丹参注射剂抑制早产儿视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成的实验研究

　　近年来，随着围产医学技术的发展，早产儿的存活率大大提高，早产儿视网膜病变(retinopathy“prematur沂,ROP)的发生率也随之提高，，并成为儿童致盲的重要原因，占儿童致育原因的6%-18%。

　　以目前对ROP的发病机制的研究，主流观点普遍认为血管内皮生长因子(VEGF)是刺激视网膜新生血_管形成，最终导致ROP发生的关键因索丹参是我国传统医学中应用最广泛的药物之一，被应用于治疗新生儿缺血缺氧性脑病(HIE)、新生儿窒息后心肌损害等。因此，本研究通过建立PLOP动物模型，观察丹参注射剂对视网膜新生血管的抑制作用。

　　材料和方法

　　1.高氧诱导的早产儿视网膜病变实验动物模型的建立与分组:SPF级初生健康C57BL/6J幼鼠(中山大学实验动物中心提供)8窝(每窝1只母鼠和6}8只幼鼠)共54只，遵照随机原则分为3个大组:单纯对照组(A组)、高氧诱导组(B组)和丹参治疗组((C组)，每组18只。参考Pierce陈宜6及陈小凤7等报道的ROP动物模型制备法，将B组和C组小鼠(各18只)于出生后第7天(postnatal7days，记为P7)与哺乳母鼠一起放人氧气分压为(7512)%的密闭饲养箱中饲养5天，期间用氧浓度测氧仪监测并调控箱内的氧分压，控制室温在(23士2)0C,P12返回正常空气环境中饲养。A组小鼠(18只)一直保持在正常空气环境中饲养C组的小鼠(18只)从P7开始腹腔注射丹参注射液，0.2m1，每日一次，直至小鼠被处死。

　　2.视网膜铺片Isolectin-B4(GREEN)染色:于P12,P14,P17时各取A,B,C三组小鼠6只，颈椎脱臼处死小鼠，取左侧眼球于4%多聚甲醛中固定，30-40min，在显微镜下分离出视网膜，放射状切开，置于5%BSA-0.5%Triton-X100中(约70闪/EP管)封闭渗透，4℃过夜(或室温孵育1h);将封闭渗透液吸出，加人稀释好的抗体(Isolectin-B4:1:200，用570BSA封闭液稀释),40C,避光过夜(以下步骤均避光),PBST洗四遍，每次30min，最后平铺于载玻片).以打:荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜(Zeiss,A}ioplan2Imaffing)下观察视网膜血管的形态与分布。

　　3视网膜新生血管内皮细胞核计数:上述三个时间点二组小鼠的右眼,470多聚甲醛溶液固定24-48h,梯度酒精脱水二甲苯透明，在软石蜡中浸30,硬石蜡I,II中各1h，平行于角膜至视盘的矢状位平面连续6m切片，贴片，用二甲苯脱蜡梯度酒精脱水常规苏木精一伊红染色，每只眼球间断取10个病理切片，相邻两个切片间隔60Nm(10个切片)光学显微镜下计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目，统计平均每只眼球每张切片突破内界膜的m!_管内皮细胞核数。

　　4.EGF免疫组织化学染色:从上述二个时间点的A组、B组及C组中各随机抽取20张未经染色的切片，进行VEGF免疫组织化学染色。具体方法:以兔抗小鼠VEGF抗体(1:100)为一抗(福州迈新生物技术开发有限公司)，缓冲液(PBS)代替一抗做空自对照，非免疫兔血清门:100)代替一抗做同型抗体对照，山羊抗兔为二抗(福州迈新生物技术开发有限公司)，显色剂为二氨基联苯胺(DAB)，按标准SP检测试剂盒说明进行免疫组织化学染色，以细胞胞浆呈棕黄色为阳性，光镜下观察视网膜各层中的YEGF表达。

　　5.统计学处理:选择SPSS13.0软件进行统计学分析，结果采用均数士标准差，各组的计数资料的对比采用完全随机对照实验资料的方差分析，以尸<0.05为差异具有统计学意义。

　　结果

　　丹参注射液对模型小鼠的生长状况的影响(幼对照组小鼠毛色光滑、柔顺，体重增长;高氧诱导组小鼠在氧箱内的第3}4天开始，毛发已明显发黄、干燥无光泽，体重增长较其他两组明显慢;而治疗组小鼠毛色及体重增长均与对照组相仿。

　　(2)对三组小鼠的身长和体重进行完全随机设计资料的方差分析:P12时，对照组小鼠的体重与身长均明显高于高氧诱导组和治疗组(F=8.973,P=0.001;F=15.444,P=0.000)，但是高氧诱导组和治疗组小鼠的差异不大。至P14时，对照组小鼠身长显著长于高氧诱导组和治疗组(F=13.768,P二0.000)，高氧诱导组小鼠体重明显低于治疗组与对照组(F=7.958,P=0.002)，但是治疗组与对照组的体重差异不大2.Isolectin-B4(GREEN)染色法视网膜铺片(1)对照组:P12时视网膜深浅两层血管网清晰可辨，浅层血管呈放射状向周边网膜分布，管径较粗大，深层血管呈网状均匀分布，视网膜中央血管自视乳头发出后，距视乳头约1PD处开始形成分支血管，未见无灌注区(图1Al);P14及P17时视网膜血管网发育进一步成熟(图1A2,A3)(2)高氧组:在P12时即可见视网膜中央血管白视乳头发出后，距视乳头约lOPD才发出第一级分支，中央区可见大片无灌注区形成，周边部视网膜血管明显扩张、高度迂曲，血管网分布稀疏(图1B1);P14时视网膜中央血管显著变细，分支进一步减少，周边部视网膜无灌注区扩大，血管出现不规则腊肠样改变，可见散在的新生血管形成荧光渗漏灶(图1B2);P17时视网膜巾央血管显著迂曲，分支走行紊乱，全网膜见广泛新生血管形成(图1B3)o(3)治疗组:在P12时视网膜中央血管自视乳头发出后，距视乳头约5PD可见第一级分支形成，中央区亦可见大片无灌注区形成，但周边部视网膜血管网发育明显较治疗组分布均匀，较接近对照(图1Cl);P14时视网膜中央区无灌注仍清晰可见，但周边部视网膜尤灌注区无明显打一大，视网膜血管未出现明显不规则扩张，未见明显的新生血管形成(图1C2);P17时视网膜中央血管显著扩张，但分支走行基本规则，中央区无灌注仍存在，部分血管有扩张的表现，但基木未见新生血管形成。

　　3.视网膜新生血管细胞核计数P12三组小鼠视网膜切片中基本米见突破内界膜的血管内皮细胞核对照组小鼠在P14,P17仅在少数切片中见突破内界膜的血管内皮细胞核。P14时对照组、高氧诱导组和治疗组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数量分别为(4.171士5.724)个/片，(84.331士3.765)个/片，(22.837士2.156)个/片，三组差异有显著统计学意义(F=10451.987,P<0.000)P17时对照组、高氧诱导组和治疗组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数量分别为(5.171士6.918)个/片，(148.174126.265)个/片，(46.003士14.641)个/片，三组差异有显著统计学意义(F=104.051,P<0.000)。高氧诱导组小鼠在P14和P17的计数中，P<0.000，差异具统计学意义;而治疗组小鼠在P14和P17的计数中，P=0.096，差异没有统计学意义(图2)4.VEGF的免疫组织化学检测对照组小鼠视网膜VEGF的阳性表达较高氧诱导组及治疗组显著少，并基本上集中在靠近内界膜的神经纤维层及内核层。在高氧诱导组及治疗组的小鼠中，P12时的VEGF表达接近对照组在P14时高氧诱导组小鼠VEGF的表达明显增强，主要集中在神经纤维层，在内丛状层可以见到表达的增加，并可见突破内界膜的表达;治疗组小鼠VEGF的表达主要集中在神经纤维层，但是表达明显少于高氧诱导组。P17时高氧诱导组小鼠可在神经纤维层，节细胞层、内丛状层、内核层和突破内界膜的部位见到VEGF的表达明显增强，突破内界膜部位VEGF表达尤其显著;治疗组小鼠视网膜各层中VEGF的表达则明显弱于高氧诱导组，而与P14时的表达接近(图3)。

　　讨论

　　本实验利用氧诱导视网膜病变模型，旨在研究，丹参注射液对视网膜新生血管的十预和治疗作用。

　　结果显示应用丹参注射液后，视网膜各层中的VEGF表达显著减少，最终表现为视网膜新生血管的生成显著抑制。VEGF具有促进血管生成的作用，Pierce等，研究发现，高氧状态可抑制VEGF的表达，从而有防止血管增生的作用，但是回到正常氧浓度环境中，未血管化的视网膜相对缺氧，又导致厂VEGF大量产生，形成新生血管，甚至出血和渗出。

　　近年来手术的发展在控制ROP病程、防止严重病变发生、治疗严重ROP方面发挥着主导作用。常规的激光光凝或冷冻治疗通过破坏外周视网膜无血管区，减少VEGF的分泌，从而延缓和阻断新生血管纤维化增殖，适用于阑值ROP。但是如果患儿的病变进展到4期或5期后，手术的成功率低，预后很差，这使得多年来学者们不断摸索预防及早期药物干预治疗。近年来随着新生血管发病机制的深人研究，有关新生血管抑制剂Bevacizumab(商品名Avastin及Renibizumab(商品名Lucentis)在新生血管性眼部疾病治疗中应用的研究也越来越多。国外已有报道，对W期、阂值前期及I=l值期ROP患眼玻璃体腔注射Bevacizumab进行治疗或配合激光光凝治疗，发现其可以有效抑制ROP}fij的新生血管形成。

　　但Avastin至今未获得美国FDA批准用于治疗眼部新生而_管性疾病，Lucentis仅获批用于治疗年龄相关性黄斑变性，同时，Avastin眼内注射后的严重并发症也使得眼科医生对用药与否持十分慎重的态度，研究表明，单纯注射Avastin对于4,5期的ROP尽管可抑制新生血管的生成，但对纤维增殖同样不起抑制作用，甚至可导致纤维增殖条索的收缩而加速视网膜脱离的发生’3我们的实验研究结果清晰显小，经过丹参注射液的早期十预，小鼠视网膜新生血管的形成显著受到抑制我们认为，其可能的作用机制如下:

　　1.血流动力学改善:促进已发生障碍的微循环血流速度加快，增加毛细血管交叉网点数目、微血管内红细胞流速、流态恢复正常，改善细胞代i}}状况3川。丹参的扩血管作用可能是由于其中的紫草酸B及其衍生物脱a_轻基一3,4一二羚基紫草酸有内皮依赖性或非内皮依赖性血管平滑肌松弛作用此外，内皮素一1(ET-1)具强烈的缩血管作用，新生儿窒息后血浆中ET-1水平显著升高，}Vu等人’4发现，在大脑局部缺血缺氧老鼠中，如果使用丹参注射液，内皮素的基因表达在大脑皮质和尾状核明显下降。丹参的扩张血管作用可缓解组织的缺血、缺氧，使VEGF的分泌减少，从而抑制视网膜新生血管的生长。

　　2.抗过氧化作用:丹参中的有效成分丹参酮

　　且_A磺酸钠和水溶性酚酸类物质均具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基作用，其中以含量最高的丹酚酸A和B活性最强，可降低脂质过氧化物含量，稳定细胞膜，还能抑制还原型辅酶T1(NADPH)的消耗和保护过氧化物歧化酶(SOD)和谷眺甘肤过氧化物酶的活性，有效地防治大脑及心肌缺血后的再灌注损伤，临床使用对缺血缺氧症状的恢复及降低脑病后遗症均有显著作用，且研究证明使用越效果越好。

　　3.对细胞因子的影响:姜开余等15研究了丹参素对血小板、自细胞和血_管内皮细胞表达各种细胞就附分子，包括P选择素、细胞间载附分子、血管细胞戴附分子、E选择素的影响，结果丹参素对白细胞蒲附具有明显的抑制作用，可抑制肿瘤坏死因子。

　　(TNF-a)诱导VCAM-1,E-selection表达增加，说明丹参素对细胞因子活化内皮细胞有抑制作用，从而利于保护血管内皮，减少白细胞的勃附，这可能是其发挥抗血栓形成作用的机制之一二4.丹参中的不同活性成分间作用:相互协调、相互作用，发挥综合协同作用，反映了中药多途径、多靶点、多成分综合整体效应，可能弥补现有的单一药物成分治疗作用的局限性其中在对一大血管性疾病的研究中发现，丹参中的丹酚酸B可以通过抑制基质金属蛋白酶(MMP)2和9的卜调，下调由SDF-1。所激活的细胞外信号调节激酶(ERKl/2)效应}6;通过抑制细胞表面趋化因子受体(CXCR4)的表达，阻断基质细胞衍生因子一la(SDF-la川行生因子受体((CXCR4)诱导的下游细胞效应，抑制血管平滑用L细胞的迁移和增殖的特性我们的实验研究仍存在许多不足:(1)由于实验条件的限制，氧浓度和温度未能达到维持恒定的水平。(2)丹参腹腔注射的剂量仅一种，未能行不同的剂量的效果观察}(3)由于小鼠的血管纤细，给药途径设为腹腔注射，与静脉注射是否存在药效差异。(4)给药的起始时间、用药的疗程长短是否对疗效存在影响(5)由于实验条件的限制，观察时间仪到P17等。

　　丹参及复方丹参注射液已在临床应用较长时间，治疗对象包括成人、儿童及新生儿，米见使用后出现明显副作用及毒性反应的有关报道。需进一步临床研究证实丹参在微血管病变中的作用。

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