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高三尖杉酯碱对人视网膜色素上皮细胞增生影响的实验研究

http://www.cnophol.com 2007-12-5 16:50:40 中华眼科在线

    【摘要】    目的  探讨高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)增生的抑制及其细胞周期的影响。方法  采用MTT法检测50%细胞生长抑制率时HHT的药物浓度,并用此浓度作用于培养的人视网膜色素上皮细胞,用免疫细胞化学染色分析观察RPE细胞的Ki-67表达,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果  HHT抑制培养的人色素上皮细胞的增生与药物剂量成正比,50%细胞生长抑制率时HHT的药物浓度约为4.77 mg/L,Ki-67阳性细胞率在对照组和HHT组分别为89.1%和33.8%(P<0.01),两组中阳性细胞核积分光密度值分别为60.7±5.7和29.6±7.8(P<0.01)。流式细胞仪检测细胞周期变化示HHT组G1期细胞比例由72.14%增至83.95%,G2?鄄M期细胞比例由15.46%下降至3.18%。结论  HHT可抑制RPE细胞的增生。HHT作用后RPE细胞中G0?鄄G1期细胞增多,G2?鄄M期细胞明显减少,HHT对G2?鄄M期细胞有杀伤作用。HHT有望成为防治视网膜脱离复位术后发生增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的一种新药。

【关键词】  色素上皮 视网膜 细胞 培养 增生 高三尖杉酯碱 流式细胞术

  Experimental research on inhibition of proliferation in cultured human retinal pigment epithelial cells by homoharringtonine

    CHEN Wen, HU Yizhen, JIANG Fagang,et al.

    Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan China, 430022

    [Abstract] Objective  To study the effect of homoharringtonine (HHT) on inhibiting proliferation and altering cell cycle in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells.  Methods  The effect of HHT on the proliferation of RPE was measured by the MTT method at concentrations of 0.001 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、and 30 mg/L. The effect of HHT on the expression of Ki-67 in cultured human RPE cells was detected by immunohistochemistry at a 5 mg/L concentration. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle. Results  The IC50 concentration of HHT was 4.77 mg/L. The relationship between the log concentration of HHT and the growth inhibition rate of RPE cells was linear. The proportion of the cells showing positive staining to Ki-67 in the control group and the HHT-treated group was 89.1% and 33.8% (P<0.01), respectively, and the integral optical density value for expression of Ki-67 in the two groups was 60.7±5.7 and 29.6±7.8 (P<0.01), respectively. The percentage of cells in the G1 phase of the cell cycle increased from 72.14% to 83.95%. The percentage of cells in the G2 phase of the cell cycle decreased from 15.46% to 3.18%.  Conclusion  HHT can inhibit the proliferation of RPE cells. Under its effect, RPE cells in the G0-G1 phase increased while those in the G2-M phase significantly decreased. HHT can kill RPE cells in the G2-M phase. It has the potential to become a new drug for PVR.

    [Key words] pigment epithelium, retina; cells, cultured; proliferation; homoharringtonine; flow cytometry

 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是视网膜脱离复位术失败的主要原因,主要与视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)的病理性增生有关。控制RPE细胞的增生,促使RPE细胞的凋亡,是防治PVR的一种途经[1,2]。目前常用的玻璃体手术治疗难以防止术后再增生,应用的抗代谢药物(道诺霉素[3]、丝裂霉素C[4]、5-氟尿嘧啶[5])因具有较强的毒副作用及不肯定的疗效而受到限制,寻找一种安全有效的药物是临床医生追求的目标。高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)是我国所特有的一种中药,是从三尖杉植物——海南粗榧中提取的四种活性成分之一。本实验通过研究HHT对人RPE细胞增生及细胞周期的影响,探讨HHT药物的作用机制,为HHT应用于临床提供理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  主要试剂  Delbecco改良的Eagle培养基(Delbeccon’s modified Eagle’s medium,DMEM)干粉(Gibco产品),胰蛋白酶(Difco产品),胎牛血清(Gibco产品),高三尖杉酯碱(HHT),鼠抗人细胞角蛋白(Anti-Cytokeratin Pan)单克隆抗体,鼠抗人Ki-67单克隆抗体和链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(streptavidin biotin-peroxidase complex,SABC)试剂盒(Boster产品)和DNA染色试剂盒(Coulter DNA Stain Kit)(Coulter产品)。

    1.2  方法

    1.2.1  人RPE细胞的培养及鉴定  人RPE细胞取自20~35岁意外死亡12 h内人的眼球,人RPE细胞的分离、培养方法参见文献[6],选第3~第6代细胞用于实验。细胞鉴定采用Boster公司试剂盒作角蛋白免疫组化检测:鼠抗人细胞角蛋白(Anti-Cytokeratin Pan)单克隆抗体作第一抗体,对照组用PBS替代第一抗体,以SABC法行免疫细胞化学染色。

    1.2.2  MTT实验检测人RPE细胞增生  取第3代RPE细胞接种于96孔板中,密度为1×105细胞/ml,每孔100 ?滋l,加入含100 U/ml青霉素,100 g/ml链霉素,20%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h后将培养液换成含0.001、0.01、0.1、1、10、20、30 mg/L七种浓度HHT的20%胎牛血清的DMEM液100 ?滋l,对照组为不含HHT的等体积培养液,每个浓度设5个复孔,另设空白对照组。培养12 h后,更换成不含HHT的培养液继续培养24 h,然后每孔加入5 g/L MTT 20 ?滋l,继续培养4 h后,弃上清液,加入二甲亚矾150 ?滋l,振摇15 min后,于酶标仪550 nm波长下测OD值,并以下列公式计算:细胞抑制率=(空白对照组平均OD值-处理组平均OD值)/空白对照组平均OD值×100%。HHT50%抑制浓度(IC50)通过将药物浓度取常用对数后作自变量,细胞增殖抑制率作因变量,然后求出直线回归方程而得出。

    1.2.3  HHT对人RPE细胞Ki-67表达的影响  将细胞接种于含玻片的12孔板中培养24 h,换成含HHT 5 mg/L的20%胎牛血清的DMEM液培养,同时设不加药组作正常对照,培养12 h后撤药,加入20%胎牛血清的DMEM液继续培养24 h,取出长有细胞的玻片固定,用鼠抗人细胞Ki-67单克隆抗体作第一抗体,染色时设阴性对照组用PBS替代第一抗体,SABC法行免疫细胞化学染色。显微镜(×400)下计数5个视野中阳性细胞数,计算阳性细胞数占细胞总数的比率。实验组与对照组每组选3张细胞标本,每张选取48~55个非边缘区的阳性细胞,采用MPIAS-500真彩色医学图像分析系统测定免疫组化片阳性细胞核的积分光密度(OD)。

    1.2.4  流式细胞仪分析人RPE细胞周期  细胞以5×104细胞/ml密度接种,24 h后换成含HTT(5 mg/L和50 mg/L)的培养液培养同时设对照组,培养12 h后撤药,加入20%牛血清的DMEM液继续培养24 h,消化收集细胞,用PBS制成单细胞液,放-20℃ 和75%冰乙醇中固定,调整细胞密度为1×106/ml,取100 ?滋l样品加入等体积DNA染液,室温放置20 min,流式细胞仪以488 nm激发光测定,每种浓度重复3次。

    1.2.5  统计学方法  数据采用SPSS 10.0软件包处理,将药物浓度取常用对数后作自变量,细胞增殖抑制率作因变量,求出直线回归方程。实验组和对照组人RPE细胞的Ki-67表达率采用?字2检验,Ki-67表达阳性细胞核的积分光密度采用u检验,流式细胞仪分析人RPE细胞周期采用t检验。

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(来源:中华首席医学网)(责编:xhhdm)

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