2 结果
2.1 细胞培养及鉴定 原代培养的细胞多呈多边形或扁形,胞浆内富含棕褐色颗粒,3~4周铺满。细胞传代2~3次后色素颗粒逐渐减少,消失,细胞呈梭形。阳性细胞角蛋白染色细胞染成棕黄色,呈纵横交错的网状结构。
2.2 HHT对体外培养的人RPE细胞的抑制能力与浓度的对数值呈线性关系。回归方程为Y=0.426+0.109 LogX,Y为HHT对体外培养的人RPE细胞的抑制能力,X为HHT浓度,IC50时HHT的浓度为4.77 mg/L(见图1),回归系数经t检验得,t=9.194,P<0.01。
2.3 HHT影响人RPE细胞的Ki-67表达 阴性对照片隐约可见细胞核边界,细胞核未染色,细胞浆淡染(见图2)。正常对照组多数细胞呈阳性反应,即细胞核染为棕黄色,边界清楚,细胞核仁呈棕黑色,细胞浆色淡(见图3)。HHT实验组细胞核染色明显变浅,细胞浆颜色变化不大(见图4)。显微镜下实验组计数的148个细胞中,阳性细胞占33.8%,对照组显微镜下计数的110个细胞中,阳性细胞占89.1%,两组间阳性细胞率差异有非常显著性(?字2=78.92,P<0.01)。实验组与对照组分别检测阳性细胞数149和156个,阳性细胞细胞核积分光密度值分别为29.6±7.8和 60.7±5.7,两组差异有非常显著性(u=39.61,P<0.01)。
2.4 流式细胞仪分析人RPE细胞周期 HHT作用后人RPE细胞中G0-G1期细胞增多,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);G2-M期细胞明显减少,与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01)(见表1)。
3 讨论
高三尖杉酯碱(HHT)是自三尖杉属植物中分离出来的生物碱,是我国所特有的一种中药,主要被用于治疗白血病,其治疗白血病的机制为对S期细胞杀伤较明显,可直接对核酸的结构与代谢发生作用,也可抑制蛋白质合成而干扰DNA合成,导致细胞发生死亡。近来还有报道称HHT可通过下调端粒酶活性而诱导白血病HL-60细胞的凋亡[7~9]。过去我们在防治外伤性PVR的实验研究中报道过,体外HHT可显著抑制成纤维细胞增殖,它对结膜成纤维细胞产生50%抑制效应的浓度为0.005 mg/L,并且HHT玻璃体注射不会导致正常眼组织的毒性损害[10]。目前研究认为PVR主要与RPE细胞的病理性增生有关,因此控制RPE细胞的增生,促使RPE细胞的凋亡,是防治PVR的一种途经[2,3]。本实验通过研究HHT对RPE的影响,为HHT应用于临床防治PVR提供理论依据。本次研究发现,HHT可明显抑制RPE的增生,它对RPE细胞的生长抑制率与其浓度的对数成正比,它对RPE细胞产生50%抑制效应的浓度约为4.77 mg/L,约为对成纤维细胞产生50%抑制效应的浓度的一千倍,原因可能为RPE细胞的增生能力较成纤维细胞弱。从HHT对RPE细胞表达Ki-67的影响也可以看出HHT可明显抑制人RPE细胞的增生。从细胞生长周期看,HHT对RPE细胞的细胞周期影响一方面是使RPE细胞集中在G1期,可能的机制是通过在G1期控制某种蛋白的合成而阻止RPE细胞从G1期进入S期,从而使RPE细胞周期延长,另一方面HHT又使G2-M期细胞明显减少,可能的机制是HHT对G2期细胞有杀伤作用,从而减少RPE细胞进入分裂期,这两方面的共同作用达到了抑制RPE细胞增生的目的。总之,HHT是通过影响G1期和G2期来共同抑制RPE细胞的增生。我们的下一步研究包括:HHT可否诱导RPE细胞的凋亡,HHT在玻璃体内药代动力学研究以及使用治疗浓度时药物的安全性。
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