3讨论

    以往实验表明眼球振动、纤维素、白蛋白、血影细胞等加速硅油乳化，但都是使用低粘度硅油，这些因素对高粘度硅油的乳化没有显著作用[2]。工业传统乳化方法耗能高，微粒大小不易控制，用来模拟人眼内乳化硅油模型不理想。膜乳化法是指分散相受压后通过微孔膜，自发形成单分散性乳化液。此种方法能量消耗低、微粒直径和微粒分散性可控和只需低切应力。微孔膜最大优点是孔径均一，能制备单分散乳化液[3]。我们采用微孔膜膜乳化法制备乳化硅油，不需加入其他乳化剂，有利于研究纯硅油小滴对RPE细胞吞噬活性的影响。使硅油在1个大气压下通过孔径为0.45μm的微孔膜制得的小滴直径为4.25±0.77μm，制得硅油小滴至少可以稳定5d。使用酞箐蓝染料标记硅油小滴。酞箐蓝染料是一种化学性质非常稳定的化合物，对光、热、酸、碱呈高度稳定性，由于其在一定条件下对细胞产生光毒性作用，近年来用于光动力治疗肿瘤等疾病。Glassberg等[4]报道酞箐类染料在缺乏激光激发以及浓度低于25mg/L时，对细胞没有毒性作用。用来标记硅油，对细胞活力、发育或基本生理特性不会有影响。由于酞箐蓝是油溶性染料，不溶于水，可认为染料对硅油标记有特异性。比较不同组RPE细胞内吞标记的硅油小滴数量来研究不同因素对RPE细胞吞噬活性的影响。

    RPE细胞具有多种复杂的生化功能。吞噬消化光感受器外节脱落的膜盘，对外节的更新和光感受器的存活至关重要[5]，是其重要的功能之一。这种选择性吞噬作用称为特异性吞噬。此外， RPE细胞还具有非特异性吞噬功能，即能吞噬无特异性辨别位点的物质，如聚乙烯微球、胎盘兰染料、黑色素小滴等。非特异性吞噬与RPE细胞膜上的慢速摄取受体有关[6,7]。细胞骨架在RPE细胞非特异吞噬时起一定作用。其中肌动蛋白有助于RPE对异物的摄取；内吞物在RPE细胞内移动至初级溶酶体有赖于微管的参与[8]。在长期硅油填充的患眼中，RPE细胞与硅油小滴接触，非特异性识别、并吞噬，可能引起一系列RPE细胞生物学行为的改变。我们在体外用RPE细胞与硅油小滴共孵育，观察细胞吞噬硅油小滴，结果显示RPE细胞有较强的吞噬活性。我们用乳化硅油液与RPE细胞共孵育，RPE细胞内吞硅油小滴的数量随硅油浓度递增而增加，并且没有显示明显的饱和状态，可能与实验选用乳化硅油浓度稍低有关。另外，如选用纯的PBS液作为对照组，并未加入其他RPE细胞可识别、吞噬的物质，因此，与其他物质相比，硅油小滴能否增强RPE细胞的吞噬能力，以及其他物质刺激RPE细胞吞噬是否呈浓度依赖性，还需进一步实验证明。

    血清能刺激RPE细胞的吞噬活性。Mayerson等[9]的研究显示，在RPE吞噬过程中，识别和摄取是高度特异化的过程，血清在吞噬过程中至关重要。在比较RPE细胞和巨噬细胞的吞噬机制时，Irschick等[10]发现血清能适度的增加RPE细胞对细菌的吞噬。这种刺激作用可能与血清中含有多种活性因子有关。Miceli等[11]报道，在血清刺激RPE 细胞吞噬外节时，玻璃体结合蛋白起一定作用。Hall等[12]认为RPE细胞的吞噬作用需要血清的存在。而血清中的Gas6，一种维生素K依赖的血清蛋白，在此过程中可以完全替代血清。同时还发现蛋白质S，也是维生素K依赖的血清蛋白，与Gas6结构高度相似，在血液中的作用与Gas6相似。此外，Edwards[13]发现，血清刺激RPE细胞吞噬作用仅发生在RPE细胞顶端。因此，在炎症、外伤或其他视网膜疾病情况下，血浆外渗使RPE暴露在血清中，刺激吞噬活性。本实验结果表明，用微孔膜制备乳化硅油液，能够很好的模拟人眼内硅油乳化的情况。RPE细胞对硅油小滴的吞噬呈浓度依赖性，此过程中血清可能刺激RPE细胞对硅油小滴的吞噬。

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