1   材料与方法

    1.1   实验动物   SD乳鼠（1~3日龄），由成都中医药大学动物实验中心提供。

    1.2   主要试剂   层粘连蛋白（ROCHE公司）、多聚鸟氨酸、硼酸、硼砂（沈阳化学试剂厂）、胰蛋白酶、DMEM培养基（GIBCO公司）、羊抗鼠IgG（华美生物工程公司）、小鼠抗大鼠单克隆抗体和PI（SIGMA公司）、DEPC（Sigma公司）、trizol（Invitrogen公司）、EDTANa2（国药集团化学试剂有限公司）NucleoSpin RNA cleanup试剂盒（MACHEREYNAGEL，Germany）等。DSX由中药灯盏花提取。

    1.3   主要仪器   HBO50型倒置相差显微镜（德国ZEISS公司）、超净工作台（苏州医疗器械厂）、MCO-150A型二氧化碳培养箱（日本三洋公司）、大鼠Oligo芯片、LuxScan 10KA双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）等。

    1.4   培养器皿的制备   25 cm2培养瓶和直径35 mm培养皿（内置盖玻片），以0.1 mg/ml多聚鸟氨酸（polyLornithine，硼酸缓冲液稀释）室温包被2 h后，再以4 μg/ml层粘连蛋白(laminin， PBS液稀释)包被，37 ℃过夜备用。以羊抗鼠IgG（1∶100，PBS液稀释）室温包被培养皿24 h，继以小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体（1∶150，PBS液稀释）室温包被24 h。

    1.5   RGCs的培养   出生1~3天SD乳鼠20只断头处死，无菌条件下取眼球，体视显微镜下钝性分离视网膜，0.125%胰蛋白酶消化20 min，用220目网眼无菌钢网滤过，小牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，去上清，加20%DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液后加入经羊抗鼠IgG和小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体包被的培养皿，37 ℃条件下孵育30 min，使视网膜神经节细胞与Thy-1.1单克隆抗体充分结合，去上清，用无血清培养液反复漂洗，清除培养皿表面未黏附的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化10 min，小牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，去上清，加20%DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液。计数后按每瓶5×105个细胞加入经多聚鸟氨酸和粘连蛋白包被的培养瓶和培养皿。

    1.6   视网膜神经节细胞体外培养   按以上方法制备的纯化RGCs，培养24 h后，取出培养皿内置的盖玻片，固定，用Pischinger法进行鉴定。

    按以上方法制备的纯化RGCs 18瓶，培养24 h后随机分为3组，实验组加入DSX（终浓度0.1 mg/ml），模型组和空白对照组不加药物，实验组和模型组用带T型三通管的橡皮塞将培养瓶密闭，用打气球从T型三通管注入除菌空气，从与培养瓶相通的压力表中读取压力值，达到预定的80 mmHg，加压时间4 h，空白对照组不加压，37 ℃，5%CO2孵箱培养，并在规定时间取出，利用流式细胞仪进行凋亡细胞的检测。

    按以上方法制备的纯化RGCs 30瓶，培养24 h后随机分为3组，每组10瓶，实验组加入DSX（终浓度0.1 mg/ml），模型组和空白对照组不加药物，实验组和模型组用带T型三通管的橡皮塞将培养瓶密闭，用打气球从T型三通管注入除菌空气，从与培养瓶相通的压力表中读取压力值，达到预定的80  mmHg，加压时间4 h，空白对照组不加压，37 ℃，5%CO2孵箱培养，并在规定时间取出，利用基因芯片进行凋亡基因的检测。

    1.7   统计学方法   采用SPSS 14.0版统计软件包进行统计，多组间比较用单因素方差分析，多组间两两比较用q检验，差异基因的表达用t检验。

上一页  [1] [2] [3] [4] 下一页