1 bHLH转录因子对视网膜干细胞状态的维持

    RSC/RPCs有两种分裂方式：一种是对称分裂，生成两个子细胞都是祖细胞；另一种是不对称分裂，生成的两个细胞可以是一个神经细胞和另一个祖细胞，也可以是两个同类或不同类的神经细胞。在视网膜的发育过程中，RSC/RPCs通过对称分裂来实现自我复制，以提升细胞数量；而随着时间的推移，RSC/RPCs转换自身的功能，通过不对称分裂实现多向分化潜能，分化为不同亚型的细胞[3, 4, 8]。因此，为了确保有足够的细胞数量和丰富的细胞类型，维持干细胞状态是十分必要的。已经有研究表明，抑制型bHLH转录因子Hes1在RSC/RPCs干细胞状态的维持中扮演着非常重要的角色[9]。Hes1最初出现于视泡和视茎，后来才被视网膜神经层的RPCs表达。Hes1在胚胎视网膜的异常增高表达（misexpression）可维持干细胞状态而抑制神经元分化；相反，Hes1裸突变小鼠的视网膜干细胞不能很好的增殖，从而导致小眼畸形[10]。Hes1缺失引起的Mash1表达上调可以推动神经元的分化，导致分化较早的几种神经元数目增多，而分化较晚的几种神经元数目减少[11]。要达到足够的细胞数量和分化出各种类型的细胞有赖于干细胞状态的维持，而Hes1的存在对其显然是必要的。

    Hes家族的另一成员Hes5也表达于RPCs。虽然Hes5纯合型突变小鼠的眼球形成基本正常，但是Hes1-Hes5双重裸突变的小鼠却缺乏视茎[6]。这也就是说，双重裸突变小鼠的RPCs增殖比单纯Hes1裸突变的RPCs增殖损伤得更严重，提示我们Hes1协同Hes5共同维持着RPCs的干细胞状态。

    Hes1和Hes5都是Notch信号途径中关键的转录因子[7]。Notch受体被邻近细胞上的配体激活后，Notch胞内段（Notch intracellular domains, NICD）从跨膜区域裂解并转位到细胞核。NICD与细胞核上的DNA结合蛋白RBP-J结合后，激活其下游转录因子Hes1和Hes5的表达[7, 12, 13]。这样，Notch信号将外源性的信号（相邻细胞的Notch配体）和内源性的转录因子（Hes1、Hes5）联系起来共同调控细胞分化。这些研究结果提示我们，在胚胎期的视网膜，细胞间相互作用，通过Notch及其配体激活Hes1和Hes5的表达，有利于干细胞状态的维持。与这一观点相符的是，在神经节细胞产生的高峰期，当细胞与细胞相互接触激活Notch信号时，仅有13%~14％的祖细胞发育为神经节细胞；而当这些细胞彼此隔离开来时，这些祖细胞则大部分都发育为神经节细胞[6]。

    2神经元细胞的命运决定与bHLH转录因子

    活化型bHLH转录因子如Mash1、Math3、Math5、NeuroD等表达于多种分化的神经元[12]。目前已知活化型bHLH转录因子在脑组织中促进神经元的分化并抑制胶质细胞的分化[14]。而在视网膜的发育中这些bHLH基因的异常增高表达也可导致仅有神经元细胞而没有胶质细胞的产生[15]。在神经元分化过程中，抑制型bHLH转录因子被活化型转录因子阻抑的具体机制尚不明确，但Hes家族的另一成员Hes6有可能参与到这一过程中。Hes6可直接抑制Hes1的活性并促进Mash1的活性，其结果是Hes6促进了神经元的分化[16]。Hes6这一独特的功能可以部分的归结于它的环形（loop）区域：Hes6的环形区比Hes家族的其它成员都要短[16]，这提示环形区在特定的功能中扮演着重要角色。

    尽管活化型bHLH基因促进了神经元的分化，但是它们并不能单独使神经元细胞亚型发育完善。例如，虽然双极细胞表达Mash1并且其发育需要Mash1的参与，但是Mash1的异常增高表达主要是引起光感受器的产生[6]。这样其它因子参与神经元细胞亚型的正常分化的可能性就大大增加了。最近的研究提示同源结构域（homeodomain, HD）基因对这一过程同样十分重要，这一点在下面也将提到。

    2.1 NeuroD Yan等[17]运用逆转录病毒介导的基因异常增高表达方法对鸡的视网膜中NeuroD在光感受器细胞命运决定中的作用进行了研究。NeuroD在视网膜神经上皮层异常增高表达所产生的光感受器细胞层有3层细胞，而正常的光感受器细胞层只有两层细胞。神经节细胞、无长突细胞或双极细胞的数量则没有显著变化。在视网膜色素上皮的培养体系中运用逆转录病毒介导的NeuroD异常增高表达可以产生光感受器细胞而没有其它的视网膜神经元细胞形成[17]。这些研究结果提示在脊椎动物的视网膜中NeuroD对光感受器细胞的产生非常重要。对小鼠视网膜进行的NeuroD异常增高表达研究表明光感受器细胞并不是唯一受到影响的细胞[18]。NeuroD裸突变小鼠的视网膜组织神经胶质细胞和双极细胞的数量都有所增加，视杆细胞的数量有所减少，无长突细胞的分化延迟。相反，使用逆转录病毒在大鼠的视网膜祖细胞过度表达NeuroD时，体内胶质细胞的发育被完全阻断，双极细胞的数量减少，而对无长突细胞的发育是有利的，视杆细胞的数量也有所增加。然而，也有学者观察到NeuroD在鸡或非洲蟾蜍视网膜的过度表达并未有利于无长突细胞的发育[12, 18]，这或许可以解释为种属差异，因为NeuroD仅在啮齿类动物的无长突细胞中被发现。此外在NeuroD裸突变小鼠的光感受器层还检测到了细胞凋亡的增加，提示NeuroD还可能有利于光感受器细胞的存活。

    2.2 Mash1 对小鼠的研究表明，虽然Mash1在视网膜发育过程中被表达，但是Mash1裸突变的小鼠无论在胚胎期还是出生时都没有发现明显的视网膜异常[19]。而神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和视锥细胞都是出生前就开始分化[20]，因此可能是这些分化较早的细胞不需要Mash1的参与。有学者对Mash1裸突变小鼠出生后不久的视网膜组织进行了研究[21]，这一时期正是视杆细胞、双极细胞和神经胶质细胞开始发育的时候[20]。在这些视网膜组织中，发育较晚的细胞如视杆细胞和双极细胞的分化都延迟了，双极细胞的最终数量也显著减少[21]。尽管没有水平细胞在出生后发育，也观察到了水平细胞分化的延迟，提示Mash1在出生前影响水平细胞的分化率或出生后的某一时期仍有水平细胞的分化。还有科学家推测Mash1对光感受器细胞的分化有直接影响[12, 22, 23]。通过电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay）发现，Mash1可与视蛋白启动子上的E-box元件特异性结合。这一结果提示Mash1可能对视蛋白的表达进行调控，因此在视杆细胞的分化中扮演了角色。然而在Mash1裸突变小鼠的视网膜中，视杆细胞仍可以正常分化或分化有所延迟，因此也许有其它基因可以替代Mash1的作用。NeuroD就是一个候选基因，因为视杆细胞在分化时表达NeuroD，而且NeuroD同样具备与视蛋白启动子上的E-box元件结合的功能[24]。

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