1材料和方法

    1.1材料 DMEM/F-12（Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient F-12 Ham's）和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司，层黏连蛋白（Laminin）购自Gibco公司，抗细胞角蛋白1（cytokeratin-1，CK1）pAb和四甲基异硫氰基若丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC）标记的山羊抗家兔IgG购自美国Santa Cruz公司。使用Olympus BX51型荧光显微镜、Olympus CK40型倒置显微镜及数码摄影系统、Labsystems-MK3酶联免疫检测仪等。

    1.2方法 成人眼球由中国医科大学附属第四医院眼库提供。采用酶辅助的显微分离法[3]对30只人眼IPE细胞进行分离，所有操作均在层流室和超净工作台内进行。自赤道部环行剪开眼球，角膜面向下沿虹膜根部剪下虹膜，PBS液洗3次，滴加0.2g/L依地酸(ethylenediaminotetracetic acid，EDTA)和2.5g/L胰酶联合消化液，37℃消化10~15min，含100mL/L胎牛血清的DMEM/ F12培养液终止消化，在活体显微镜下用虹膜恢复器刮取下IPE层细胞，PBS液洗3次，离心去上清，加入含100ml/L胎牛血清的DMEM/ F12培养液，反复吹打悬起细胞，计数后接种于培养瓶中，置于37℃，50mL/L CO2孵箱中培养。48h后观察，每3~5d换液1次，当细胞达到80%~90%融合时，按1∶2传代。以细胞贴壁生长、互相融合、能够正常传代为培养成功。取第3代细胞，分别加入100mg/L的层黏连蛋白，使其在培养液终浓度分别为0，1，5，10mg/L，观察细胞形态。

    1.2.1 MTT法测IPE的生长曲线 第3代细胞经胰酶消化后制成5×105/L的单细胞悬液，充分混匀。取7个96孔板，分别接种细胞10孔×4行，每行为1组，加入层黏连蛋白溶液，使终浓度分别是0，1，5，10mg/L，200μL/孔，置37℃，50mL/L CO2恒温箱中培养。培养后1~7d上午10:00各取1板，每孔加入5g/L四甲基偶氮唑盐（MTT）20μL，置37℃，50mL/L CO2恒温箱中孵育4h。弃去上清，每孔加入150μL二甲亚砜(DMSO)，轻轻震荡混匀，常温下15min后测定各孔在570nm的吸光度值(A 570)，做出生长曲线。

    1.2.2间接免疫荧光法检测CK1的表达 取传代的第3代细胞，分别加入层黏连蛋白溶液，使培养液终浓度分别为5和10mg/L。培养3d后，PBS漂洗3×5min，40g/L多聚甲醛固定30min后，PBS再漂洗3×5min，5mL/L聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）100漂洗3×5min，100g/L BSA于4℃下封闭过夜。分别加1∶100(体积比)稀释一抗（CK1抗体），37℃恒温孵育1h，5mL/L TritonX-100漂洗3×5min，加入1∶100(体积比)稀释二抗（山羊抗家兔IgG-TRITC），37℃恒温孵育40min，PBS漂洗3?min，终止反应，甘油-PBS（9∶1，体积比）封片，应用Olympus BX51型荧光显微镜观察并拍照，记录CK1的表达情况。

    统计学处理：使用计算机SPSS10.0统计软件进行数据分析。

    2结果

    2.1 IPE细胞分离培养 分离获得的成人IPE细胞呈黑色，圆形，接种后2~3d贴壁，贴壁后1~2d开始伸展，细胞面积小，呈多边形，细胞核呈空泡状，细胞质周围可见大量色素颗粒聚集。随着传代次数的增加，细胞内含有的色素越来越少，细胞铺展面积增加，大量细胞迅速脱色素。传代4~5次之后，细胞开始出现浓缩、衰老，培养液中可见多数色素颗粒漂浮，继续传代则大量崩解，仅残存少数细胞贴壁，但不再生长，逐渐消失。

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