IPE细胞的生长情况 A：原代培养的IPE细胞呈黑色，圆形，贴壁伸展，呈多边形，细胞核呈空泡状，细胞质周围可见大量色素颗粒聚集（×100）;B：传代后IPE细胞内色素颗粒明显减少（×200）;C：传代5次之后，IPE胞质浓缩、伸出突起，培养液中可见多数色素颗粒漂浮（×100）

    2.2层黏连蛋白对IPE细胞的影响 在本培养体系中，低浓度层黏连蛋白（1和5mg/L）作用下，IPE细胞生长曲线大致呈S形；1mg/L组和对照组差异不显著（P >0.05），5mg/L组IPE细胞增殖明显增强，和对照组之间的差异有统计学意义（P <0.05）；10mg/L组IPE细胞增殖明显减弱，和对照组之间的差异有统计学意义（P <0.05，图2）。

       2.3层黏连蛋白对IPE细胞CK1表达的影响 免疫荧光显示，培养获得的IPE细胞的细胞角蛋白（CK1）染色均为阳性，但在0，1，5mg/L组细胞呈多边形，在10mg/L组细胞聚集成团，聚集早期CK1表达呈强阳性，晚期减弱。

    IPE细胞CK1的表达（间接免疫荧光法） A：0，1，5mg/L组IPE细胞CK1呈阳性表达（×400）;B：10mg/L组IPE细胞聚集早期CK1强阳性，晚期细胞聚集形成无结构的角化小体CK1表达减弱（×100）

    3讨论

    IPE细胞移植为治疗RPE损害引起的视网膜疾病开辟了广阔的前景。自体IPE 细胞移植取材方便，排除了移植中出现的免疫排斥反应，因此用自体IPE细胞移植治疗老年性黄斑变性被人们寄予厚望。近年来研究发现，体外培养的IPE在吞噬、维生素A代谢以及制造神经营养因子等方面都具有类似RPE的功能[2]；用自体IPE细胞代替RPE细胞移植到视网膜神经上皮下，以解决RPE细胞移植中存在的排斥反应及材料来源已成为研究的热点。

    由于IPE细胞与下方的无色素上皮细胞及虹膜基质之间无Bruch膜相分离，而且IPE细胞与虹膜基质之间的连接以及IPE细胞之间的连接都较为牢固，因此其分离和纯化培养较难，直至Hu[3,4]通过比较多种分离培养方法，明确酶辅助的显微分离法为最佳的分离方法。本研究亦在此基础上成功进行了IPE细胞的原代培养，而且证实了低浓度的层黏连蛋白（5mg/L）可以明显促进IPE细胞增殖，但高浓度的层黏连蛋白（10mg/L）则会明显抑制IPE细胞的增殖。推测是由于一定浓度的层黏连蛋白促进了IPE在培养皿表面的黏附，提高了细胞贴壁生长的存活率[5]。另一方面，层黏连蛋白作为上皮细胞基底膜的主要成分，促进了IPE的上皮细胞性状的表达，CK1表达明显增强；而细胞角蛋白是上皮细胞的特异性标志，由于IPE细胞来源于神经外胚层，CK1抗体染色呈阳性[6]。但是高浓度的层黏连蛋白在明显增加细胞内角蛋白表达的同时，也就是促进了上皮细胞的角化和老化，IPE细胞呈现出聚集、无结构的角化体，细胞的增殖能力也随之明显下降，表现为生长曲线下降的趋势。提示在本研究的培养体系中，层黏连蛋白在一定浓度下可以优化培养支持物表面的性状，增加IPE细胞的黏附和存活；但在高浓度下又会增加细胞内角蛋白的表达，从而促进IPE的老化，抑制其增殖活性；添加一定浓度的层黏连蛋白（5mg/L）有利于IPE细胞的体外培养。
  

上一页  [1] [2] [3] [4] 下一页