图3　角膜干细胞移植治疗角膜缘碱烧伤角膜基质浸润评分  

图4　角膜干细胞移植治疗角膜缘碱烧伤术后角膜病变总评分

讨论　　Pellegrini等［7］用患者自体角膜缘组织与3T3-J2细胞(成纤维细胞)共同培养形成细胞层，再移植于创伤角膜表面，经治疗后再行角膜移植获得了成功；Hodson［8］认为通过自体角膜缘干细胞移植术后患者角膜的正常免疫屏障功能得到维持，干细胞增殖后逐渐恢复角膜上皮细胞的完整结构并防止新生血管及结膜上皮的长入，且能够保持角膜上皮的特性。临床上常可见双眼角膜缘干细胞损伤后功能障碍的患者，均对健眼取材顾虑较大，Williams等［9］报道健眼取材后可发生长期损害，致使自体角膜缘干细胞移植受到许多限制，为此促使我们行异体角膜缘干细胞培养后进行细胞移植治疗的研究。  

　　一、体外培养角膜缘干细胞的特性 

　　体外培养的兔和人角膜缘干细胞在培养的初期(传第1、2代)与体内角膜干细胞具有相似的生物学特征，即增殖能力高、具有干细胞固有的分化特征。角膜干细胞移植适用于角膜缘功能衰竭症［10，11］的治疗。 

　　二、动物模型和干细胞载体选择 

　　本研究采用新西兰大白兔作为角膜缘碱烧伤的动物模型，用羊膜作为角膜干细胞生长的载体，是因为羊膜来源丰富、透明、无免疫原性，具有作为细胞赖以生长的基质替代物及刺激细胞增殖形成多层细胞结构的特性，可促进结膜组织再生修复［12］。将羊膜的上皮细胞消化刮除是为接种角膜缘干细胞生长提供理想的细胞基质。培养条件下的角膜上皮细胞在羊膜的细胞面增殖形成密集的细胞层，组织学染色显示细胞形态与角膜上皮细胞一致，具备进行细胞移植的条件。 

　　角膜缘碱烧伤后干细胞损伤致使角膜上皮细胞的再生来源障碍，角膜中央上皮细胞逐渐脱落。角膜缘的免疫屏障功能损伤，可使角膜的免疫赦免功能破坏，造成角膜炎性反应的长期反复发生，同时角膜缘干细胞丧失了增殖能力，使结膜上皮细胞易于进入和新生血管形成，角膜发生上皮剥脱、基质浸润、结膜上皮化和新生血管形成。 

　　三、羊膜干细胞移植治疗效果 

　　角膜缘干细胞移植治疗后，兔角膜上皮恢复完整性、新生血管减少、基质炎细胞浸润减轻、透明性增加，说明移植的角膜缘干细胞在受体角膜中存活并进行增殖分化形成角膜上皮细胞。本实验结果显示角膜缘炎性反应轻，与体外培养的角膜缘干细胞可能丧失某些免疫源性而导致角膜缘炎性反应轻有关。 

　　本实验由于观察时间较短，仅仅是一个初步的动物实验观察，并且本实验旨在临床应用该方法治疗角膜缘功能障碍，但尚需进一步研究。 

　　参考文献 

　　1　Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, et al. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell, 1989, 57 : 201-209. 

　　2　Tseng SC. Concept and application of limbal stem cells. Eye, 1989, 3: 141-157. 

　　3　Pfister RR. Corneal stem cells disease: concepts, categorization, and treatment by auto-and homotransplantation of limbal stem cells. CLAO J, 1994, 20 : 64-72. 

　　4　Coster DJ, Aggarwal RK, Williams KA. Surgical management of ocular surface disorders using conjunctival and stem cell allografts. Br J Ophthalmol, 1995, 79:977-982. 

　　5　Tsubota K, Toda I, Saito H, et al. Reconstruction of the corneal epithelium by limbal allograft transplantation for severe ocular surface disorders. Ophthalmology, 1995, 102 : 1486-1496. 

　　6　Williams KA, Roder D, Esterman A, et al. Factors predictive of corneal graft survival：report from the Australian Corneal Graft Registry. Ophthalmology, 1992, 99 : 403-414. 

　　7　Pellegrini G, Traverso CE, Franzi AT, et al. Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium. Lancet, 1997, 349 : 990-993. 

　　8　Hodson S. Cultivating a cure for blindness. Nature, 1997, 387 : 449. 

　　9　Williams KA, Brereton HM, Aggarwal R, et al. Use of DNA polymorphisms and the polymerase chain reaction to examine the survival of a human limbal stem cell allograft. Am J Ophthalmol, 1995, 120 : 342-350. 

　　10　潘志强，张文华，孙葆忱. 角膜干细胞增殖与分化表达实验研究. 中华眼科杂志，1999，35：19-21. 

　　11　潘志强, 张文华. 人角膜缘干细胞体外培养的增殖与分化研究. 眼科研究, 1999, 17: 81-83. 

　　12　Shimazaki J, Shinozaki N, Tsubota K. Transplantation of amniotic membrane and limbal autograft for patients with recurrent pteryium associated with symblepharon. Br J Ophthalmol, 1998, 82 : 235-240.

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