【摘要】 目的：了解不同类型白内障患者晶状体上皮细胞（lens epithelial cell，LECs）的凋亡情况及其与Fas蛋白（CD95）的关系。方法：取年龄相关性白内障、糖尿病性白内障及高度近视并发性白内障患者超声乳化手术中取下的前囊膜标本共73例。应用光镜、透射电镜及TUNEL标记法观察LECs的凋亡情况。同时应用免疫组化和流式细胞分别定性、定量检测Fas蛋白（CD95）在LECs中的表达。结果：光镜下3种白内障患者的LECs都呈透明样变性，细胞内有空泡。电镜下可见正常以及变性、坏死的LECs。部分LECs细胞内染色质凝集并边缘化，呈早期细胞凋亡改变。TUNEL检测发现3种白内障患者的LECs中均有TUNEL阳性细胞存在，LECs的凋亡率分别为（32.20±7.91）%、（31.00±9.43）%、（28.20±8.04）%，3种白内障间未见统计学差异。免疫组化结果表明在3种白内障患者的LECs中均有Fas蛋白（CD95）表达。流式细胞定量检测年龄相关性、糖尿病性及高度近视并发性白内障患者LECs中Fas蛋白（CD95）的表达量分别为（65.72±9.95）%、（63.46±13.30）%、（31.46±17.25）%，高度近视并发性白内障LECs中Fas蛋白（CD95）的表达与其他两种白内障间存在统计学差异（t检验，P<0.05）。结论：年龄相关性白内障、糖尿病性白内障及高度近视并发性白内障患者的LECs均出现凋亡，LECs的凋亡很可能是非先天性白内障发病的细胞病理学基础。Fas蛋白（CD95）介导的LECs的凋亡在年龄相关性白内障及糖尿病性白内障的形成中起重要的作用，而在高度近视并发性白内障LECs凋亡中可能存在其他通路。
【关键词】 晶状体上皮细胞 凋亡 Fas蛋白 免疫组化 流式细胞
0引言
目前白内障是全球第一位致盲眼病，在全球4000万～4500万盲人中，因白内障致盲者占46%。随着全球人口的老龄化，白内障的发病率及患者人数在不断上升[1]。近年来人们建立了多种类型的白内障模型来研究LECs凋亡与白内障形成的关系，现在多数学者都认为LECs的凋亡是非先天性白内障发病共同的细胞病理学基础。我们观察了年龄相关性白内障、糖尿病性白内障及高度近视并发性白内障患者LECs凋亡情况，并通过对3种白内障患者LECs中Fas蛋白（CD95）的检测来探寻其与LECs的细胞凋亡之间的关系。
1材料和方法
1.1材料
取本院眼科200212/200402行白内障超声乳化手术的73例（73眼）患者的晶状体前囊膜。患者年龄在42～85（平均62）岁。年龄相关性白内障诊断标准为视力<0.5,晶状体混浊，无其他引起视力下降的眼病。糖尿病性白内障诊断标准为视力<0.5,晶状体混浊，糖尿病2～10a,无其他引起视力下降的眼病。高度近视并发性白内障诊断标准为视力<0.5,晶状体混浊，双眼高度近视，矫正度数为6.00～12.00D,无其他引起视力下降的眼病。
1.2方法
取超声乳化手术中环行撕囊取下的前囊膜用20g/L戊二醛固定24～72h，二甲砷酸钠缓冲液漂洗，10g/L锇酸后固定，酒精梯度脱水，Epon812包埋，半薄切片定位，超薄切片，片厚0.5nm，铀铅复染2～3min，透射电镜观察。原位细胞凋亡检测：TUNEL试剂盒，购自美国R&D公司。实验步骤按试剂盒说明书进行。免疫组化：Fas抗体购自福州迈新生物技术有限公司。取包埋好的蜡块做切片厚4μm，实验步骤按SP法免疫组化试剂盒进行。将超声乳化手术中环行撕囊取下的前囊膜置于BSS液中，0℃保存。取出前囊膜放入消化液（50g/L胰酶0.2mL+EDTA 0.8mL）中，37℃温箱作用15min，每5min振荡一次，然后用加3mL冷PBS以终止消化。液体经300目的滤过尼龙网过滤，以2000转/min离心5min。弃去上清液，加PBS100μL重悬细胞，加20μL的FITCCD95抗体，4℃闭光，作用时间30min。加PBS至2mL，2000转/min离心5min，然后弃上清液。加PBS 2～3滴，重悬后上机检测。
统计学处理：以Stata 7.0统计软件对LECs的凋亡率和Fas蛋白定量检测结果进行配对t检验。检验水准α为0.05。
2结果
2.1电镜观察结果
透射电镜下，LECs细胞内可见空泡变性（图1）,部分细胞的细胞器肿胀，细胞皱缩,细胞核中染色质固缩周边化,呈早期凋亡改变（图2）。
2.2 TUNEL标记结果
在3种白内障患者的LECs中均可见TUNEL标记阳性的细胞（图3，4）。
2.3免疫组化结果
在3种白内障患者的LECs中均见有Fas蛋白表达，阳性表达LECs中可见棕黄色颗粒均匀分布（图5，6），而阴性表达LECs的胞质中无棕色颗粒（图7）。表1 各组患者LECs的凋亡率（略）
2.4流式细胞定量检测结果
Fas蛋白（CD95）的表达量在年龄相关性白内障中较高为（65.72±9.95）%，糖尿病性白内障两种蛋白的表达量亦较高，为（63.46±13.30）%，高度近视并发性白内障的表达量较低，为（31.46±17.25）%。经单因素方差分析表明在年龄相关性白内障、糖尿病性白内障中无差异（P＝0.909）；在年龄相关性白内障和糖尿病性白内障与高度近视并发性白内障患者均有显著性差异（P<0.01）。
3讨论
3.1 LECs凋亡的检测
随着细胞凋亡研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和新的方法对细胞凋亡进行检测。大致可以从细胞形态、DNA含量、细胞内组分检测及细胞膜的变化来检测细胞凋亡。电镜超微结构的观察是诊断细胞凋亡最可靠的指标，尤其是凋亡小体的发现。但电镜只能定性而无法定量，而且观察到凋亡小体的几率也不高，因为在体内实验时凋亡细胞形成的凋亡小体会很快被巨噬细胞等清除，不易被观察到。本实验中电镜下未观察到LECs的凋亡小体，只看到LECs固缩变形，线粒体肿胀，细胞内有大量空泡，染色质凝集边缘化，细胞间连接似绒毛状。这些近似早期凋亡细胞改变。原位标记法又称为TUNEL法，可在原位检出凋亡细胞断裂的DNA。尽管实验方法复杂、费时，但是TUNEL实验可以在培养细胞、石蜡包埋或冰冻切片上进行，因此具有较好的定位作用(表1)。此外，只要凋亡的细胞DNA中有一定量的断裂点形成，就可以出现阳性反应,因此敏感性较高。它是一种集细胞形态学和分子生物学为一体的检测凋亡的方法。目前它是人们检测LECs凋亡常用的方法之一。Li等[2]采用末端脱氧核酸转移酶介导的生物素标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸末端缺口标记法(TUNEL), DNA梯状图谱标记技术及电镜观察等手段对不同类型的人类白内障晶状体上皮细胞进行检测，发现各型白内障患者的上皮细胞有4.0%～41.8%出现了凋亡，而在正常人的晶状体上皮细胞中仅发现了极少量的凋亡细胞。Maruno等[3]Lee等[4]Muzio等[5]Vrensen等在白内障的实验研究中均证实晶状体上皮细胞凋亡是白内障形成中的早期事件。本研究对两种白内障患者的LECs进行TUNEL标记，发现两种LECs中均存在TUNEL阳性细胞，凋亡率在20.16%～40.11%之间，两种之间没有统计学差异。这也与前人的研究相似，说明晶状体上皮细胞凋亡是非先天性白内障发病的共同细胞病理学基础。
3.2 Fas蛋白与白内障患者LECs的凋亡
随着凋亡与疾病关系的研究，晶状体上皮细胞凋亡与白内障发生的关系已引起人们注意。目前认为细胞凋亡至少有线粒体通路、死亡受体通路及内质网通路3条通路参与凋亡的发生。死亡受体Fas聚集后，Fas通过胞内段的DD募集胞质中的Fas相关死亡结构域(fas associated death domain,FADD)。FADD氨基端含有一个死亡效应结构域(death effector domain,DED)，此DED和caspase8原域中的DED相互作用，把caspase8募集到Fas区域，Fas，FADD和caspase8形成了死亡诱导信号复合体(death inducing signaling complex，DISC), caspase8酶原自我剪切活化成活性caspase8。活化的caspase8可激活下游的caspase3, caspase6和caspase7,剪切胞质和核底物,包括多聚ADP核糖多聚酶(poly ADP ribose polymerase，PARP)，DNA PK，Lamin B，蛋白激酶Ｃθ(protiein kinase Cθ，PKCθ)和ICAD(Inhibitor of caspase activated DNAase)。ICAD剪接成CAD后移入核内,降解染色质DNA。Okamura等[6]比较了年龄相关性白内障和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的凋亡情况发现在有增殖性视网膜病变(DR)的囊膜样本中TUNEL阳性细胞的百分比明显高于年龄相关性白内障组(P＜0.05)。免疫组化及RTPCR表明有DR的白内障组Fas及其mRNA的表达增高。电镜下DR的白内障组中具有卷曲的核及凝集的染色质特征的暗细胞，这些暗细胞中的染色质有大量的3OH DNA末端，明显高于年龄相关性白内障组(P＜0.01)。凋亡在合并DR的白内障中发挥重要的作用，并且可能是通过Fas介导的途径。
本研究中年龄相关性白内障患者的LECs中Fas蛋白表达高于高度近视并发性白内障，两组之间有统计学差异。提示在年龄相关性白内障LECs中Fas蛋白介导的细胞凋亡在其发病过程中有重要作用；而高度近视并发性白内障可能存在其他介导LECs凋亡的通路。
【参考文献】
1葛坚.眼科学.第1版.北京:人民卫生出版社 2002:119
2 Li WC,Kuszak JR,Dunn K, et al. AM Cotliar and M Weiss.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common celluar basis for noncongenital cataract development in humans and animals. J Cell Biol 1995;130:169181
3 Maruno KA, Lovicu FJ, Chamberlain CG, et al. Apoptosis is a feature of TGF betainduced cataract. Clin Exp Optom 2002;85:7682
4 Lee JH, Wan XH, Song J, et al. TGFbetainduced apoptosis and reduction of Bcl2 in human lens epithelial cells in vitro. Curr Eye Res 2002;25:147153
5 Muzio M, Stockwell BR, Stennicke HR, et al. An induced proximity model for caspase8 activation. J Biol Chem 1998;273:29262930
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