中华眼科杂志 1999年第1期第35卷 眼表疾病
作者：李岩 庞国祥 詹素华 金玉梅 孙玉敏 李莹 李维业
单位：100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院眼科
关键词：细胞凋亡；准分子激光角膜切削术；伤口愈合
【摘要】 目的 寻找准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy,PRK）术后细胞凋亡和激活增殖的动态联系,评价激光去除上皮（phototherapeutic keratectomy,PTK)和机械刮除上皮（mechanical epithelial scrape,MES）对凋亡和增殖的影响。方法 对18只兔按PTK和MES行PRK（-9.90 D,6.0 mm直径），术后定期用活体共聚焦显微镜观察及制作病理切片，TdT介导dUTP缺口末端标记（TdT mediated terminal dUTP nick ending labeling, TUNEL）原位显示凋亡细胞，激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态，定量统计比较凋亡水平差别。结果 PRK术后角膜基质细胞出现凋亡，程度与角膜基质细胞减少和其后增殖有关。PTK组4小时角膜基质细胞凋亡和减少水平较MES组低，1个月时激活和增殖水平亦低。结论 PRK术后立即出现了角膜基质细胞减少和凋亡，其水平与后期基质细胞激活和增殖密切相关，推测基质细胞凋亡是引起创伤修复的起始因素；PTK-PRK较MES-PRK基质细胞凋亡少和减轻术后激活水平。
The apoptosis and proliferation after photorefractive keratectomy
LI Yan, PANG Guoxiang, ZHAN Suhua, et al.
Department of Ophthalmology, Peking Union Medical College Hospital,
Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To search the correlation between the apoptosis and proliferation of keratocytes and investigate the influence of phototherapeutic keratectomy (PTK) and mechanical epithelial scrape (MES) on keratocyte apoptosis and proliferation.Methods Rabbit corneas received photorefractive keratectomy (PRK, -9.9 diopters, 6mm diameter). Animals were evaluated subsequently up to 6 months after surgery by in vivo confocal microscopy. Corneas were prepared for H.E. staining, corneal cell apoptosis was evaluated by terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) to detect DNA fragmentation.Results Loss of keratocytes and keratocyte death were found anteriorly in the remaining stroma at 4h after PRK. Activated keratocytes observed by confocal microscopy repopulated within 1 month. A significant elevation of apoptosis was detected in keratocytes and epithelium at 4h, 3d, 1m after PRK. The level of keratocyte apoptosis was parallel to the loss of keratocytes at the early stage and was correlated with keratocyte proliferation in the later stage, PTK-PRK was associated with lower levels of central corneal apoptosis and activated keratocytes than MES-PRK.Conclusion It is suggested that the loss of keratocytes and keratocyte apoptosis be correlated with keratocyte activation and proliferation, which may result in haze and regression after PRK，and PTK-PRK induce lower level of early keratocyte apoptosis and late keratocyte activation than MES-PRK.
【Key words】 Apoptosis Photorefractive keratectomy Wound healing
准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)术后上皮下雾状混浊(haze)和屈光回退是临床上最常见的术后并发症［1］。相关研究表明,角膜haze和屈光回退与基质成纤维细胞的激活增殖、过度分泌有密切的关系［2］。通过对细胞增殖和死亡平衡机制的理解，控制伤口修复中细胞过度激活，或许有助于改善屈光性角膜手术的效果。Wilson等［3］研究表明，角膜上皮创伤可引起基质细胞凋亡(apoptosis)。细胞的增殖与凋亡相互平衡以维持细胞正常功能和数量稳定，在生理和病理过程中具有重要意义［4］。为寻找PPK术后细胞凋亡和激光增殖的动态联系，评价激光去除上皮(phototherapeutic keratectomy，PTK)和机械刮除上皮(mechanical epithelial scrape，MES)对凋亡和增殖的影响，我们在兔PRK活体模型上，用角膜共聚焦显微镜动态观察其术后创伤修复反应［5］，同时用TdT介导dUTP缺口末端标记(TdT mediated terminal dUTP nick ending labeling,TUNEL)方法，探讨涉及伤口修复中这一可能机制［6］。
材料与方法
一、材料
1. 试剂：TUNEL试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)：含TdT酶及贮存液，荧光素标记的dUTP等核苷酸及反应缓冲液，羊抗荧光素抗体-碱性磷酸酶联合物；蛋白酶K(美国Merk公司)；DNA酶Ⅰ(美国Gibco公司)；碘化乙啶(propidium iodide,PI)(北京中山生物技术公司)；氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(nitro-blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate,NBT/BCIP)(北京中山生物技术公司)。
2. 动物：选择体重2～3 kg的新西兰纯种白兔18只，雌雄兼有，健康无眼病（本院动物室提供）。
3. 仪器：（1）准分子激光治疗仪SVS Apex （美国Summit Tech公司）；（2）角膜活体共聚焦显微镜 （日本Tomey公司）；（3）激光扫描共聚焦显微镜Ultima 212 （美国Meridian公司）。
二、方法
1.实验分组：将18只纯种新西兰白兔按PTK和MES随机分组，分别于术后4小时、3天、1个月及3个月各选取4只眼，另设正常对照4只眼。
2．动物模型建立：采用SVS Apex准分子激光治疗仪，激光参数：波长193 nm，频率10 Hz，能量密度180 mJ/cm2。按每公斤体重25 mg苯巴比妥静脉麻醉，表面麻醉剂滴眼，MES和PTK组分别去除直径为6.5mm角膜上皮，然后行PRK治疗，脉冲268，矫正-9.90 D。
3．共聚焦显微镜活体观察：先滴表面麻醉剂，然后采用Tomey共聚焦显微镜对准角膜中心区进行扫描，放大倍数为490，行图像采集处理。
4．组织病理切片和苏木素-伊红（HE）染色：分别于术后4小时、3天、1及3个月处死动物，立即摘除眼球，常规固定、包埋、病理切片和HE染色，光镜下观察病理形态变化。
5．TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)：参照TUNEL试剂盒方法，略加调整［6］：（1）脱蜡、水化；（2）微波修复：加入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH=9)，100%功率5分钟；（3）蛋白酶K预处理：质量浓度为10 μg/ml室温10分钟；（4）TdT介导的dUTP缺口末端标记：37℃孵育1小时；（5）PI（2.5 mg/ml，含0.1% RNA酶)复染：37℃孵育5分钟；（5）甘油缓冲液暂时封片，激光扫描共聚焦显微镜读片；（6）加抗荧光素抗体-碱性磷酸酶联合物，37℃孵育30分钟；（7）加显色液(10 μl NBT∶10 μl BCIP∶1 ml DIG缓冲液Ⅲ)，避光显色10分钟；（8）终止反应，伊红轻度复染，脱水封片，光镜下读片。
每次TUNEL均设立:（1）阳性对照：TUNEL前加1 μg/ml DNA酶Ⅰ，25℃孵育10分钟。（2）阴性对照：仅加dUTP反应液，不加TdT。(3)正常对照。
6.数据处理与统计分析：(1)活体共聚焦显微镜观察两组各时间点的基质细胞，由未参与实验的人员计数6～8个490倍镜下画面，单位：基质细胞数/mm2，以均值±标准差(±s)表示。(2)原位凋亡计数：取2组各时间点8个角膜切片，在各角膜切片中心区域随机取不重叠的10个高倍视野(490倍)，由未参与实验的人员自前到后全程角膜范围内，计数凋亡细胞总数，以均值±标准差(±s)表示。(3)数据采用SPSS 7.0软件中的方差分析和相关性分析。
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