结果

　　一、共聚焦显微镜活体观察PRK术后创伤修复

　　正常角膜基质细胞排列整齐，细胞核反光弱，前基质较后基质细胞数略多，形态略不规则（图1）。PRK术后4小时至3天，前基质细胞明显减少，存在低反光的空洞状无细胞区，提示手术引起基质细胞死亡，偶见小体积（＜10 μm）及强反光的致密结构，类似于核固缩破裂（图2），其下为纤长、梭形高反光的基质细胞，与其移行时呈梭形有关（图3）。1个月时基质细胞呈星形，形态类似成肌纤维细胞［5］，具有圆形反光核，细胞密度明显增加，无梭形结构，提示细胞由移行转为静止，并重新分布于前基质无细胞区； 3～6个月，细胞密度及反光进一步减低，提示激活基质细胞群逐渐消失，代之以静止细胞群。

图1　正常兔角膜前基质细胞　活体共聚焦显微镜×490

                        图3　PRK后3天角膜前基质细胞　活体共聚焦显微镜×490

　　2组在术后4小时角膜基质细胞数较正常对照显著减少（PMES=0.000 3，PPTK=0.004），术后1个月基质细胞激活增生，亦较正常时差异有显著性（PMES=0.001，PPTK=0.002）（表1）。术后4小时PTK引起基质细胞减少较MES组少（P=0.004）,术后1个月时PTK组激活的基质细胞数目较MES组少（P=0.048），其余时间点2组间差异无显著性。

    表1　共聚焦显微镜观察2组兔PRK术后不同时间角膜基质细胞的变化比较(±s，个/mm2)

组别	术前	术后
		4小时**	3天	1周	1个月**	3个月	6个月
MES-PRK	897±102	336±48	1 072±73	1 110±20	1 314±43	800±319	880±100
PTK-PRK		512±100	1 104±144	1 080±305	1 280±27	813±229	966±　57

　　*方差分析：术后4小时和1个月2组与术前相比，P＜0.05　**方差分析：PTK与MES相比，P＜0.05　　

    二、PRK术后角膜病理形态学变化

　　术后4小时至3天，前基质细胞明显减少，细胞核固缩，甚至出现了无细胞区（图4），与前共聚焦活体观察结果一致，其下成纤维细胞激活、增生；1个月时，上皮细胞层明显增加，前基质重新有大量激活基质细胞分布，具有成肌纤维细胞的特点，胶原排列紊乱。3个月时，基质细胞逐渐恢复平静，角膜结构趋于正常。

图4　PRK后4小时兔角膜病理变化　HE×200

　　三、PRK术后角膜原位凋亡检测

　　通过TUNEL直接检测DNA双链断裂所产生的3-羟基末端，从而在早期较灵敏的原位显示凋亡细胞。在激光共聚焦显微镜下观察的细胞经双标记荧光染色（PI、TUNEL），处于正常生长状态的 细胞核发出红色荧光，有DNA断端的凋亡细胞核则呈黄色。在结合抗荧光素抗体及NBT/BCIP显色后,光镜下凋亡胞核呈紫蓝色。

　　在正常角膜，凋亡细胞的表达是有限的，主要在表层上皮，而在基质细胞和内皮细胞则不表达。PRK术后TUNEL阳性的细胞明显增加，不仅整个上皮，而且在基质中也可见，但主要在前基质呈散在分布，胞核固缩（约10 μm），较正常细胞明显缩小（图5～6）。2组不同时间TUNEL阳性细胞，术后4小时至1个月，均较正常对照差异有显著性（P＜0.05）（表2）。PTK组仅在术后4小时较MES引起凋亡细胞少（P=0.003）。

表2　PRK术后不同时间2组兔角膜切面*中TdT介导

　　dUTP缺口末端标记阳性的基质细胞动态变化

　　　比较(±s，个/10个高倍视野)

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