中华眼科杂志 1998年第6期第0卷 论著摘要

作者：吴强　杨冠　陈国辉　王文清　戴友林

单位：200233 上海市第六人民医院眼科

　　后囊膜混浊是白内障囊外摘除术后的常见并发症之一，其发生的病理基础是因晶体上皮细胞的残留，进而增殖、基底膜样物质的复制以及胶原的沉积^［1］。研究晶体上皮细胞的生物学特性已成为阐述后囊膜混浊病理发生机制的重要内容。我们对晶体上皮细胞在生理状态下是否能够合成Ⅰ、Ⅲ型纤维性胶原进行了检测。

　　一、材料和方法

　　1.主要试剂和仪器：主要试剂为焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)、硝酸纤维素膜(美国Promega公司产品)，(α-³²P)-dCTP(香港Amersham远东贸易公司产品)，EcoR1、XhoI限制性内切酶、RNA快速抽提试剂、随机引物探针标记试剂盒(美国GIBco BRL公司产品)；主要仪器有超速低温离心机(HERMLE ZK 380，德国产)，紫外分光光度仪(Ultrospec 300，瑞典Pharmacia Biotech公司产品)，计算机图像分析仪(image analysis system，德国远东蔡司公司产品)。

　　2.方法：(1)细胞培养及RNA的抽提：将宰杀后新鲜小牛眼晶体囊膜截取下，按组织块培养方法进行培养^［2］，待细胞长满培养瓶底后，倾弃培养液，依次加入RNA快速抽提试剂、氯仿、异丙醇抽提RNA，经75%乙醇洗涤，用DEPC处理水溶解沉淀的RNA，测定其吸光度(A)_{260 nm}/(A)_{280 nm}比值并进行定量。(2)Ⅰ、Ⅲ型前胶原探针的制备：包含有Pro α₁(Ⅰ)cDNA的质粒pHCAL1U(670 bp)和Pro α₁(Ⅲ)cDNA的质粒pHFS3(705 bp)(芬兰Turku大学生化系Eero Vuorio教授赠送)大量抽提后，用相应的限制性内切酶酶切，电泳分离回收；采用随机引物法将(α-³²P)-dCTP分别标记到Pro α₁(Ⅰ)和Pro α₁(Ⅲ)cDNA片段中，掺入率60%，比活性为1×10⁸cpm/μg DNA。(3)Northern blot分析：参考文献^［3］所示方法，将经总RNA各20 μg经变性处理，点入1%琼脂糖变性凝胶中(含0.66 mol甲醛)电泳，然后印迹到硝酸纤维素膜上，80℃烘烤2小时；烘烤后的印迹膜在预杂交液中预杂交2小时，再分别置入含³²P标记的Pro α₁(Ⅰ)和Pro α₁(Ⅲ)cDNA探针的杂交液中杂交16～24小时，洗膜后将杂交膜暴露于X线片，在-70℃条件下曝光4～7天，显影、定影后用计算机图像分析仪进行吸光度(A)值的测定。

　　二、结果

　　牛晶体上皮细胞RNA分别经人Pro α₁(Ⅰ)、Pro α₁(Ⅲ)cDNA探针杂交、自显影后，均显示出特异的清晰条带，所表达的Pro α₁(Ⅰ)和Pro α₁(Ⅲ)mRNA均为5.8 kb、5.4 kb和4.8 kb；经计算机图像分析测定，Pro α₁(Ⅰ)mRNA显示的条带吸光度(A)值为46.8，Pro α₁(Ⅲ)为9.37。

　　三、讨论

　　体内的晶体上皮细胞具有合成晶体所特有的晶体蛋白和包裹晶体的囊膜(该囊膜是一基底膜组织)的生物学特性；体外长期培养观察也已证实，晶体上皮细胞不但能够合成α、β、γ晶体蛋白，而且尚能合成构成基底膜主要成分的Ⅳ型胶原、层粘连蛋白，以及少量的硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素^［4］。目前对晶体上皮细胞是否能够合成纤维性胶原，即Ⅰ、Ⅲ型胶原，也进行了研究。Barnard等^［5］在应用X射线衍射技术对牛晶体囊膜进行观察时发现，晶体囊膜上有Ⅰ、Ⅲ型胶原的存在。随后有人采用免疫组化方法直接对人晶体囊膜进行检测，也同样发现有Ⅰ、Ⅲ型胶原的存在^［6］；而采用同样的实验技术对体外培养的人白内障晶体上皮细胞的研究，仅发现有Ⅰ型胶原存在，并未检测到Ⅲ型胶原^［7］。Laurent等^［8］也以体外培养的牛晶体上皮细胞作为研究对象，观察发现早期培养的牛晶体上皮细胞不能检测到Ⅰ、Ⅲ型胶原，而当细胞经长期培养后可检测出Ⅰ、Ⅲ型胶原，以Ⅰ型胶原为主。迄今，尚未见进一步的研究以确定晶体上皮细胞是否能够合成Ⅰ、Ⅲ型胶原特性的报道。本实验应用探针技术，对牛晶体上皮细胞中的基因转录产物mRNA进行研究，结果表明体外培养的牛晶体上皮细胞中存在有Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因mRNA的表达，Ⅰ型前胶原基因mRNA表达量是Ⅲ型前胶原基因mRNA表达量的5倍；此外还发现Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因转录产物中均存在有三种不同碱基数的mRNA，这是由于胶原基因较大，各型胶原的各种α链结构基因在进化上相关；在其结构中插有大量的非编码序列，因此胶原mRNA前体的加工过程中，包含有大量的RNA拼接，产生不同的mRNA，在杂交过程中，Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因即可表达出多种不同碱基数的mRNA。

　　本研究从分子水平证实了晶体上皮细胞不但能够合成Ⅰ型胶原，而且同时也能表达Ⅲ型胶原，进一步揭示了晶体上皮细胞的生物学特性，对深入探讨后囊膜混浊发生的病理机制具有重要的意义。

　　参考文献

　　1　Olivero dK, Furcht LT. Type Ⅳ collagen, laminin, and fibronectin promote the adhesion and migration of rabbit lens epithelial cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1993,34：2825-2834.

　　2　鄂征，主编. 组织培养技术. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1993.18-20.

　　3　Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 分子克隆实验指南. 金冬雁，黎孟枫译. 第2版. 北京：科学出版社，1993.362-371.

　　4　Arita T, Murata Y, Lin LR, et al. Synthesis of lens capsule in long-term culture of human lens epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1993,34：355-362.

　　5　Barnard K, Gathercole LJ, Bailey AJ. Basement membrane collagen--evidence for a novel molecular packing. FEBS Lett, 1987,212：49-52.

　　6　Shigemitsu T, Majima Y, Ishiguro K. Histopathological findings of capsular opacification and retraction after intraocular lens implantation. Jpn J Clin Ophthalmol, 1991,46：502-503.

　　7　Nishi O, Nishi K, Fujiwara T, et al. Types of collagen synthesised by the lens epithelial cells of human cataracts. Br J Ophthalmol, 1995,79：939-943.

　　8　Laurent M, Kern P, Courtois Y, et al. Synthesis of types I, III and IV collagen by bovine lens epithelial cells in long-term culture. Exp Cell Res, 1981,134：23-31.

(收稿：1998-03-05　　修回：1998-06-06)