【摘要】  目的 研究豚鼠近视眼视网膜Müller细胞原代培养的方法。方法 用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞，用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况，以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果 半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后，遮盖眼眼轴延长，近视形成。原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长，胞体较大、扁平，GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论 酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法。

【关键词】  视网膜；Müller细胞；近视眼；豚鼠

    Müller细胞是视网膜最主要的神经胶质细胞，与视网膜三级神经元共同构成“神经元－神经胶质”调控网络，参与视网膜的生理、病理过程。研究发现，Müller细胞能合成一些与近视眼发生密切相关的视网膜因子，如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）[1]、多巴胺（dopamine， DA）[2]、视黄酸（retinoic acid，RA）[3]、转化生长因子β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）[4]，但是，目前尚不明确Müller细胞在近视眼形成中的具体作用及机制。豚鼠是目前国内研究近视眼的常用实验动物[5-7]，因此，我们建立豚鼠形觉剥夺性近视眼模型，探索其视网膜Müller细胞的培养方法及生长特性，为下一步研究Müller细胞与近视眼的关系打下基础。

    1  材料与方法

    1.1  豚鼠近视眼模型制作  3～4周龄的断乳三色豚鼠24只（清洁级，中南大学动物部提供），体重200～220 g，雌雄不限。随机取其中12只，以0.3％戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，用自制半透明眼罩（材料为乳白色乳胶手套）遮盖右眼，缝4针固定于眼眶周围组织，以对侧未遮盖眼作自身对照。以剩余12只豚鼠的右眼作正常对照。遮盖2周后，去除眼罩，用0.5％托吡卡胺扩瞳验光测眼球屈光度，以A型超声测量眼轴长度，测3次，取平均值。

    1.2  豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的培养  近视眼豚鼠腹腔注射0.3％戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，用75％酒精浸泡消毒5 min。在超净工作台内摘除豚鼠眼球，清除眼球外筋膜组织，用D－Hanks液漂洗3次。沿角膜缘后1 mm剪开眼球壁，去除眼前段，分离出神经视网膜，洗净附着的色素上皮。将其移入完全培养液（100 ml完全培养液由DMEM 80 ml、20％胎牛血清20 ml、青霉素100 μg/ml、链霉素100 μg/ml组成）中，用眼科显微剪刀把神经视网膜剪成小碎片，以0.25%胰蛋白酶消化10 min，用吸管吹打，制成细胞悬液。每1只眼球的视网膜接种于1个50 ml（25 cm2）培养瓶内，置于37℃、5％ CO2的自动培养箱内培养，24 h后首次换液，去除悬浮细胞，以后每3～4 d换液1次，待细胞汇合成片、贴壁细胞达80％以上时按1：2传代。每天用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况。

    1.3  豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的免疫组化染色  在6孔板中预先放入盖玻片，取第2代细胞接种其上，待细胞基本融合时取出，用D－Hanks液清洗，用4％多聚甲醛固定30 min后用于免疫组化染色。主要步骤如下：①3％过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性。②5％正常山羊血清封闭室温下作用10 min。③一抗GFAP多抗（Santa Cruz公司，浓度1：100）、Vimentin多抗（Santa Cruz公司，浓度1：100）于4℃过夜。④生物素标记二抗工作液于37℃孵育30 min。⑤辣根酶标记链霉卵白素工作液于37℃孵育30 min。⑥以DAB显色，苏木素复染，在显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照。

    1.4  统计学方法  采用SPSS10.0统计学软件进行数据处理，对遮盖眼与对照眼的屈光度、眼轴长度进行t检验。

    2  结果

    2.1  豚鼠近视眼模型  遮盖2周后，豚鼠遮盖眼眼轴延长，近视形成。其屈光度为（-2.08±0.20）D，与自身对照眼（＋1.67±0.15）D、正常对照眼（＋1.55±0.20）D比较，差异有统计学意义（t=52.08、44.27，P<0.05）；遮盖眼眼轴长度为（8.42±0.16）mm，与自身对照眼（8.06±0.13）mm、正常对照眼（8.10±0.11）mm比较，差异有统计学意义（t=6.05、5.71，P<0.05）。

    2.2  豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的生长特性  　原代培养接种24 h后，部分视网膜细胞贴壁，部分细胞呈椭圆形，有的堆积成团。首次换液去除大部分混杂细胞（如神经节细胞、光感受器细胞、双极细胞等），贴壁的Müller细胞分裂旺盛，长出小突起，伸展，胞体饱满。10 d后，Müller细胞形态基本稳定，胞体较大、扁平，呈三角形、多角形或梭形等，折光性暗，胞核多为椭圆形，位于胞体中央或略偏位（见图1）。一般30～35 d后Müller细胞融合成片，相互交错或平行排列，进行传代。传代细胞多在15～20 d基本融合。第3代Müller细胞形态基本不变，生长速度减慢，细胞开始老化。第4代细胞基本停止生长，死亡速度明显加快。

    2.3  豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的免疫组化染色  90％以上的培养细胞阳性表达GFAP（见图2）和Vimentin（见图3），这些细胞的胞浆内有大量棕黄色颗粒，在胞核附近颗粒密度较高。以PBS代替一抗作阴性对照者（见图4），细胞内无GFAP和Vimentin免疫反应着色。

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