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1材料和方法
1.1材料 雄性清洁级SpragueDawley (SD)大鼠360只，体质量250±25g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）20030003;饲养条件：室温18～25℃，空气流通，相对湿度 40%～70%；动物自由摄食饮水，饲料为全价鼠颗粒饲料，由福建医科大学动物中心提供。实验分组：将SD大鼠360只，随机分为正常对照组(A)、外伤性PVR组(B)和外伤后应用GM6001组(C)，每组120只。各组再随机分为6个亚组: 1，3，7，14，21，28d，每亚组20只（20眼）；适应性饲养 1wk。免疫组化试剂：(1)人工合成基质金属蛋白酶抑制剂（GM6001）（基因有限公司）；(2) MMP9、TIMP1抗体，PV9000试剂盒，SP9003试剂盒，DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）;(3)柠檬酸抗原修复液、多聚赖氨酸玻片、PBS、过氧化酶阻断剂（福州迈新生物公司）;(4)二甲苯、无水乙醇、双蒸水，中性树胶等（国药集团化学试剂有限公司）。
1.2方法
1.2.1大鼠动物模型的建立 ACD抗凝剂准备:取枸橼酸2.73g，枸橼酸三钠4.48g，葡萄糖2g，蒸馏水100mL，配成l00mL ACD溶液，高压灭菌后备用。自体富含血小板血浆(plateletrich plasms,PRP)制备:SD大鼠鼠尾采血1mL，与1/l0体积的ACD抗凝剂混合，低速(1000r/min)离心10min，吸取上层液即为PRP。正常对照组(A)动物模型制备:250g左右SD大鼠120只，左眼为实验眼，右眼为自身对照眼。常规麻醉，散瞳，消毒铺巾，暴露左眼，在显微镜观察下，用微量注射器从颞上方睫状体扁平部即距角膜缘后2mm处向玻璃体腔内、视盘前方注入生理盐水20μL。第14d重复注射一次。外伤性PVR组动物模型制备:250g左右SD大鼠120只，左眼为实验眼，右眼为自身对照眼。常规麻醉，散瞳，消毒铺巾，暴露左眼，在显微镜观察下，用微量注射器从颞上方睫状体扁平部即距角膜缘后2mm处向玻璃体腔内、视盘前方注入已准备好的PRP血浆20μL。第14d注射生理盐水20μL。外伤后应用GM6001组动物模型制备：250g左右SD大鼠120只，左眼为实验眼，右眼为自身对照眼。常规麻醉，散瞳，消毒铺巾，暴露左眼，在显微镜观察下，用微量注射器从颞上方睫状体扁平部即距角膜缘后2mm处向玻璃体腔内、视盘前方注入已准备好的PRP血浆20μL，外伤后12h向玻璃体腔内、视盘前方注射20μL(100μmol/L)GM6001。第14d重复注射一次。3组大鼠在1，3，7，14，21，28d静脉注射戊巴比妥钠(60mg/kg)；处死动物后，立即取出左眼球，于锯齿缘后 0.5mm处剪开眼球壁，去除眼前节，分离视网膜放于40g/L甲醛中固定，待石蜡包埋、连续切片。
1.2.2免疫组化步骤 MMP9、TIMP1的免疫组化步骤(SP法):常规脱蜡至水；30mL/L H2O2去离子水孵育10min；PBS冲洗，2min×3；滴加正常兔血清封闭液，室温15min，甩去多余液体；分别滴加1：100稀释的MMP9、TIMP1一抗,，37℃ 1h；PBS冲洗，5min×3；滴加生物素标记的二抗,室温15min；PBS冲洗，5min×3；滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温15min；PBS冲洗，3min×3;DAB显色：DAB显色剂室温显色8min；自来水充分冲洗；苏木素复染、脱水、透明、封片、显微镜观察。阴性对照：PBS代替一抗。光镜下观察胞浆内呈现不同程度的棕黄色粗大颗粒反应者为抗MMP9、抗TIMP1抗体染色阳性细胞，反之染色阴性。采用Image8000彩色图像分析仪对各组免疫组化切片进行分析，方法如下：每个亚组取5张切片，用计算机图像分析仪将免疫组化切片图像通过图像采集系统以×40物镜输入，每张切片图像随机采集10幅，对图像中阳性反应部位（胞浆）进行平均灰度分析。记录相应数据，取其平均值作为该标本的结果，并对结果进行统计学检验。
统计学处理：所有统计均在SPSS 11.5软件上运行，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行单因素方差分析，以P<0.05作为差异有显著性意义的检验标准。
2结果
2.1免疫组化染色结果 免疫组化MMP9、TIMP1、蛋白均主要表达于视网膜内外网状层、视锥视杆层、神经纤维层。MMP9在正常对照组微弱表达，呈淡黄色颗粒状。MMP9在外伤性PVR组1d显著表达，呈棕黄色颗粒状，随着病程的延长，MMP9的表达呈减弱的趋势; MMP9在外伤后应用GM6001各个亚组均微弱表达。TIMP1在正常对照组中等表达，在外伤性PVR与外伤后应用GM6001各个亚组均有明显表达(图1AE)。
2.2免疫组化计算机图像分析结果 平均灰度值越低，说明免疫组化信号越强，相应的阳性表达越高。
2.2.1 MMP9的测定 外伤后1，3，7d，外伤性PVR组MMP9表达的平均灰度值均明显低于正常对照组（P<0.01）；外伤后应用GM6001组MMP9表达的平均灰度值均明显高于外伤性PVR组（P<0.01），但与正常对照组的差异均无显著性。外伤后1，3，7d，外伤性PVR组MMP9表达的平均灰度值呈增高趋势。外伤后14，21，28d，外伤性PVR组与正常对照组MMP9表达的平均灰度值的差异均无显著性。外伤后应用GM6001组与外伤性PVR组MMP9表达的平均灰度值的差异均无显著性，与正常对照组MMP9表达的平均灰度值的差异也均无显著性（图2）。
2.2.2 TIMP1的测定 外伤后各个亚组，外伤性PVR组TIMP1表达的平均灰度值均明显低于正常对照组（P<0.01）；外伤后应用GM6001组TIMP1表达的平均灰度值均明显低于正常对照组（P<0.01），但与外伤性PVR组的差异无显著性（图3）。
图1 免疫组化染色结果（免疫组织化学SP法，DAB染色，苏木素复染，×40） A：PBS阴性对照；B：正常对照组视网膜组织中TIMP1的表达；C：外伤性PVR组1d视网膜组织中MMP9的表达；D：外伤性PVR组3d视网膜组织中MMP9的表达；E：外伤后应用GM6001组1d视网膜组织中TIMP1的表达（略）
图2 MMP9在大鼠视网膜表达的平均灰度值 bP<0.01外伤性PVR组、外伤后应用GM6001组 vs正常对照组；dP<0.01外伤后应用GM6001组 vs外伤性PVR组（略）
图3 TIMP1在大鼠视网膜表达的平均灰度值 外伤性PVR组、外伤后应用GM6001组 vs正常对照组均有P<0.01（略）
2.2.3 MMP9/TIMP1的测定 对MMP9/TIMP1平均灰度值比值进行单因素方差分析结果见表1。若MMP9/TIMP1平均灰度值比值降低，则表明MMP9/TIMP1比率增高，反之则MMP9/TIMP1比率降低。外伤后1,3,7d，外伤性PVR组MMP9/TIMP1的平均灰度值比值均明显低于正常对照组（P<0.05）；外伤后应用GM6001组MMP9/TIMP1的平均灰度值比值均明显高于外伤性PVR组和正常对照组（P<0.01）；外伤后14,21,28d，外伤性PVR组和外伤后应用GM6001组MMP9/TIMP1的平均灰度值比值均明显高于正常对照组（P<0.01）；但外伤性PVR组和外伤后应用GM6001组之间的差异无显著性。外伤后1,3,7d，外伤性PVR组MMP9/TIMP1比率增高。
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