【摘要】目的:克隆人TGFBI基因 ,并构建其真核表达载体。方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区，将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中，进一步通过和Sal I双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI 中。经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:获得了人 TGFBI的编码基因，并成功建了其真核表达载体。结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定。

   【关键词】  TGFBI　角膜营养不良　真核表达

　　Cloning of human TGFBI gene and its eukaryotic expression plasmid construction

    Hong-Yan Ge, Xu-Hui Yu, Wei Shang, Xiu-Mei Zhao, Lu Zhang, Wei-Qi Gao, Ping Liu

    Department of Ophthalmology, the First Clinical College of Haerbin Medical Universtiy, Haerbin 150001, Heilongjiang Province, China

     Abstract  AIM: To clone human TGFBI gene and construct its eukaryotic expression plasmid. METHODS: The full coding domain sequence of TGFBI gene was cloned from human corneal tissue from operative spaceman with reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and was sub-cloned into pMD18-T. The targeted DNA fragment, digested with restriction enzyme XbaI and SalI, was directionally cloned into eukaryotic expression plasmid pCI. Then the reconstructed plasmid was identified with PCR, enzyme digestion and sequencing. RESULTS: Human TGFBI gene was successfully amplified and its eukaryotic expression plasmid was constructed. CONCLUSION: The successive reconstruction and verifying of eukaryotic expressive plasmid containing human TGFBI gene established the foundation of studying of the mechanisms of TGFBI gene mutation related corneal dystrophy.

    · KEYWORDS: TGFBI; corneal dystrophies; eukaryotic expression

　　0引言

    随着分子生物学的研究,近年来人们对角膜营养不良的分子遗传学研究取得了重大进展，已经确定的角膜营养不良基因有TGFBI，CHST6，K3，K12，M1SI，GSN等[1]。同时已经认识到，在中国以TGFBI基因突变导致的角膜营养不良最常见,其多为青春期发病，累及双眼且对称性，病变进展缓慢，导致角膜明显混浊，引起视力下降 。至今为止，该病的致病机制仍不十分清楚。TGFBI基因突变导致的细胞信号传导通路的异常激活是近年来研究的热点，受到越来越多的关注。成功获得人TGFBI基因并构建其真核表达载体是研究角膜营养不良的发病机制的重要物质基础。

    1材料和方法

    1.1材料 收集2006-01/12在我院行穿透性角膜移植手术供体残留的角膜组织。pCI载体和感受态大肠杆菌JM109由本实验室保存。PMD18-T载体为Takara公司产品。RT-PCR试剂盒和Trizol试剂为Invirogen公司产品;TaqDNA Polymerase,限制性内切酶（和Sal I），DNA marker均为Takara公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒为上海华瞬公司产品；T4 连接酶为New England Biolabs 公司产品；Tryptone、Yeast Extract为Oxid 公司产品；氨苄青霉素、IPTG和X-Gal购自哈尔滨宏博生物有限公司。Olig-dT通用引物为上海英俊生物有限公司产品。PCR仪（Perkin Elmetr Gen Amp PCR system 2400）。

    1.2 方法 根据GeneBank上报道的人TGFBI序列（ NM_ 000358）,利用软件Oligo primer 5辅助设计克隆TGFBI基因的上、下游引物，由上海英俊生物有限公司合成 。上游引物 hTGFBI F：5′TATATGTAGAGCCAGCATGGCGCTCTTC- GTGCG３′,下游引物 Htgfbi R：５′GTGCGTCGACCGTAA- TGCTTCATCCTCTC ３′。上游引物Ｆ的５′端设有 酶切位点，下游引物R的 ５′端设有 Sal I酶切位点。PCR产物为2 089bp。取人角膜缘组织300mg,加入Trizol试剂3mL,匀浆器匀浆。转入DEPC 7mL处理过的EP管,室温放置5min后,4℃，12 000ｇ,离心10min。加入氯仿0.6mL,用力混匀，室温放置 3min后,4℃,12 000ｇ,离心15min。取上清，加入异丙醇1.5mL，室温放置10min 后,4℃，12 000ｇ,离心 10min。弃上清，加750g/L乙醇3mL，振荡混匀,4℃,9 000ｇ，离心 5min。弃上清，空气干燥后，加入DEPC 20μL处理水溶解。根据Takara两步法RT-PCR试剂说明，建立反转录体系40μL。向上步总RNA 20μL中，加入oligo.dT 5μL,70℃水浴5min后，立即放在冰上2～3min。继续加入RNA酶抑制剂1μL，5×RT Buffer 8μL，25mmol/L dNTP 4μL， 0.1mol/LDTT 4uL，200kU/L M-MLV 1μL，混匀，37℃水浴3～4h。以反转录产物为模板，建立克隆TGFBI基因PCR反应体系，反应体系为50μL。其中模板1μL，25 mmol/L dNTP 4μL，上、下游引物各2μL，5kU/L ExTag酶0.3μL，10×ExTag Buffer 5μL。反应条件为预变性为95℃5min,94℃60s,52℃60s,72℃90s,35个循环,72℃延伸10min。

    1.2.1 pMD18-T /TGFBI亚克隆的构建 扩增产物电泳,进行 回收,按产品说明书操作。回收产物与pMD18-T载16℃过夜连接，转化感受态大肠杆菌JM109，涂布含有氨苄青霉素、IPTG和X-Gal LB平板，分别挑取蓝白斑,提取质粒用限制性内切酶和Sal I 进行双酶切鉴定，得到pMD18-T与TGFBI 重组载体。

    1.2.2 pCI/TGFBI真核表达载体的构建 重组的pMD18-T /TGFBI与载体pCI质粒用限制性内切酶 和Sal I 双切割,胶回收后通过T4连接酶进行连接,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,涂布含有氨苄青霉素的LB平板,提取质粒分别用双酶切和基因测序鉴定所筛选的阳性克隆。

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