2结果

    以人角膜组织基因组中RNA为模板进行两步法RT-PCR扩增TGFBI基因,将产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，在2.1 kb处可见条清晰明亮的目的条带，片断大小与GeneBank中公布的片断大小相等，而阴性对照无目的条带出现。

    2.1重组质粒酶切鉴定 挑选pMD18-T /TGFBI质粒阳性克隆经单切及和Sal I双酶切鉴定。挑选pCI/TGFBI质粒阳性克隆经和Sal I双酶切鉴定, 10g/L琼脂糖凝胶电泳。

    2.2重组质粒序列测定 重组质粒测序结果提交GeneBank 进行Blast 比对， 证实了所克隆的片段正确，且目的片断准确的插入到pCI中的和Sal I多克隆位点中（上海生物工程技术有限公司，D9620,p-b,t7 ）。

    3讨论

    角膜营养不良是一组原发性、遗传性、双眼性具有病理组织特征改变的疾病,由于正常角膜组织中的细胞在某种基因异常的作用下,使其结构或功能受到进行性损害所致，其共同特点为在角膜组织中形成形态各异的沉淀物，导致患者视力下降。在我国，以TGFBI基因突变相关的颗粒状角膜营养不良和格状角膜营养不良最为常见[2,3]。其中以R124C[4]，R124H[5]，R124L[6]，R555W，R555Q[7]等突变位点最常见，仍有新的不同的突变不断发现。转化生长因子诱导基因(transforming growth factorβ induced gene,TGFBI)是Munier等1997年在培养的接触于TGF-β的人肺腺癌细胞系A549的一个克隆 h3中发现了一个新基因,即命名为TGFBI基因,得到其cDNA序列,并将其定位于人染色体5q31[8]。TGFBI的基因产物是一个68 kDa的蛋白质，称为ｐ68βigh3[2,9], Munier等[2,10]首次将其称为keratoepithelin,即KE(角膜上皮蛋白)。Skonier等[8]研究发现,KE是一个由683个氨基酸组成的蛋白质,包含一个氨基端的分泌前导信号序列和一个位于密码子622～624间的羧基端RGD序列,该序列为Arg(642)-Gly(643)-Asp(644)结构。研究发现，角膜上皮蛋白中的RGD序列能与各种整合素相互作用[2,11]。

    正是由于TGFBI基因其编码的68kDa蛋白结构的特殊性，很多科学家把对TGFBI基因突变的研究转入到对其产物蛋白质的研究。有研究认为，碱基的突变可能导致其角膜上皮蛋白中氨基酸的改变，使空间结构的改变导致蛋白质的理化性质或和其它蛋白相互作用发生改变，异常蛋白质沉淀聚集在角膜中。也有研究认为，由于角膜组织没有血管及结构紧密的特殊性，致使其自清能力低，导致角膜混浊，失去透明性[2]。

    我们直接通过RT-PCR方法从人角膜移植后的材料中克隆TGFBI全长编码区，比以往通过cDNA文库筛选获得TGFBI编码区简单。通过和Sal I双酶切方法获得两端为粘性末端的外源DNA片段，然后定向、高效插入到克隆和真核表达载体中，简便易行。成功构建含有TGFBI基因的真核表达载体为研究TGFBI基因相关性角膜营养不良提供了充分的依据，为眼科遗传疾病的基础研究奠定了物质基础。

   【参考文献】

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2葛红岩,刘平. BIGH3 基因与人角膜营养不良.国际眼科杂志,2006;6(6):1386-1389

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4 Dong WL, Zou LH, Pan ZQ, Jin T, Yu J. Molecular genetic study on patients with lattice corneal dystrophy in China.Zhonghua YanKe ZaZhi,2005;41(6):523-526

5 Diaper CJ, Schorderet DF, Chaubert P, Munier FL. Clinical and immunopathological corneal phenotype in homozygotes for the BIGH3 R124H mutation. Eye ,2005;19(1):92-96

6 Dighiero P, Drunat S, D'Hermies F, Renard G, Delpech M, Valleix S. A novel variant of granular corneal dystrophy caused by association of 2 mutations in the TGFBI gene-R124L and DeltaT125-DeltaE126. Arch Ophthalmol ,2000;118(6):814-818

7 Kocak-Altintas AG, Kocak-Midillioglu I, Akarsu AN, Duman S. BIGH3 gene analysis in the differential diagnosis of corneal dystrophies. Cornea ,2001;20(1):64-68

8 Skonier J, Neubauer M, Madisen L, Bennett K, Plowman GD, Purchio AF. cDNA cloning and sequence analysis of beta ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta. DNA Cell Biol ,1992;11(7):511-522

9 Skonier J, Bennett K, Rothwell V, Kosowski S, Plowman G, Wallace P, Edelhoff S, Disteche C, Neubauer M, Marquardt H.beta ig-h3: a transforming growth factor-beta-responsive gene encoding a secreted protein that inhibits cell attachment in vitro and suppresses the growth of CHO cells in nude mice. DNA Cell Biol ,1994;13(6):571-584

10 Munier FL, Korvatska E, Djemai A, Le Paslier D, Zografos L, Pescia G, Schorderet DF. Kerato-epithelin mutations in four 5q31-linked corneal dystrophies. Nat Genet ,1997;15(3):247-251

11于洁,邹留河.BIGH3基因与角膜营养不良.国外医学眼科学分册,2002;26(1):54-58

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