【摘要】 目的：探讨5羟色胺（5hydroxytryptamine,5HT）在豚鼠近视离焦模型形成中的作用。方法：将24只4周龄的豚鼠分成2组，离焦组（18只36眼），包括离焦实验眼（右眼，戴接触镜）和离焦对照眼（左眼，未戴接触镜）；空白对照组（6只12眼）除检查外不做任何干预。将PMMA接触镜配戴在离焦组豚鼠右眼前，自然光下饲养14d后除去镜片,建立近视离焦模型。近视离焦模型建立后，分别处死实验组及空白对照组豚鼠，取出眼球,分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织。用高效液像色谱电化学检测法测定视网膜、脉络膜及巩膜组织中5HT含量。结果：在豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜内均有5HT存在，其中脉络膜中含量最高，其次为巩膜及视网膜；离焦实验眼视网膜、脉络膜及巩膜中5HT含量明显升高(P＜0.01）；与离焦对照眼及空白对照组相比较差异显著（P＜0.05）。结论：5HT可能参与了离焦性近视的形成。
【关键词】 离焦性近视 5羟色胺 豚鼠 效液像色谱 电化学检测法
0引言
近视眼是人类常见眼病之一，在普通人群中患病率很高，全世界平均患病率为25%～40%；我国是近视眼的高发地区，根据1998年在北京顺义地区以人群为基础的调查，15岁男、女学生近视眼的患病率分别达37.6%和55%[1]。长期以来，随着人类文明的发展，近视眼的发病率不断上升，一些严重的并发症可以导致失明，在世界各地近视致盲率占第4～6位，因此防治近视已成为世界性共同关心的问题。虽然对近视防治的研究已有200a历史，提出过多种假说，但是近视眼的发病机制尚不明确，因此探讨近视眼发病机制，从病因上治疗近视眼是眼科工作者要解决的关键问题。5羟色胺（5hydroxytryptamine, 5HT）是一种神经递质，存在于中枢及周围神经系统，眼内5HT对眼有很大的影响，它提高眼内压，收缩眼内血管，促进有丝分裂，改变视网膜无长突细胞生理过程。有研究发现鸡形觉剥夺近视眼模型5HT的代谢产物含量明显减少，推测5HT可能作为一种神经递质参与了形觉剥夺近视的形成，但具体作用机制尚不清楚[2]。本研究试图通过检测豚鼠实验性近视离焦组与对照组视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量是否有差异来探讨5HT在离焦性近视形成中的表达。
1材料和方法
1.1材料
德国Moller2102手术显微镜、美国Waters公司液相色谱仪,510高压泵、U6K进样器、 Wchers464电化学检测器、玻璃碳电极、Millennium色谱工作站、5羟色胺（Aldrich）、3,4二羟卞胺 (Sigma)、超声波细胞破碎机(德国drhhielscher UP2000H)高速离心机（美国 Lkb公司）。将24只4wk龄的豚鼠随机分成2组，离焦组（18只36眼），包括离焦实验眼（右眼，戴接触镜）和离焦对照眼（左眼，未戴接触镜）；空白对照组（6只12眼）除检查外不做任何干预。
1.2方法
1.2.1动物模型制作
PMMA接触镜的配带：将PMMA接触镜（镜片直径13.5mm,光学区直径10.5mm,基弧9.6mm，屈光度10.00D）配戴在健康4wk龄的三色豚鼠（由中国医科大学实验动物中心提供）右眼前，作为离焦实验眼。饲养温度维持在20～25℃,光照与黑暗周期比为12h∶12h,专用豚鼠饲料,专人饲养。白天隔2h观察豚鼠一次，若镜片脏，用棉签清理干净；若镜片脱落则及时固定。14d后除去镜片。本实验符合 Helsinki 宣言的要求，并得到中国医科大学伦理委员会的批准和实验动物中心的认可。表1 两组视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量比较（略）
1.2.2实验标本的制备
动物模型制作好后分别处死实验组及空白对照组豚鼠，立即取出眼球,无菌操作，手术显微镜下锯齿缘处切开眼球，将前段眼组织和玻璃体除去，虹膜恢复器快速分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织，快速置于灭菌的Eppendorf管中，标号后快速放入液态氮中保存，冷冻后移入70℃冰箱中储存待用。
1.2.3高效液像色谱测定视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量
将离焦组18只豚鼠（包括离焦实验眼18眼和离焦对照眼18眼）及空白对照组6只豚鼠（12眼）的视网膜、脉络膜及巩膜利用高效液像色谱测定其中5HT含量。色谱条件：BDS C18色谱柱(大连依利特色谱公司)250mm×4.6mm,电极电压0.7V,缓冲液:3mmol/L庚烷磺酸钠,100mmol/L醋酸钠,85mmol/L柠檬酸,0.2mmol/L EDTA,调PH=3.7,流动相∶缓冲液甲醇(体积比92∶8),流速:1.0mL/min。溶液配制：(1)标准溶液配制，将上述标准品用0.1mol/L高氯酸,配成质量浓度为1g/L的储备液,分析时用流动相稀释成1ng/L混合液；(2)内标溶液配制按配制标准溶液的方法,配制内标物质3,4二羟卞胺（DHBA）溶液,使其质浓度为4mg/L；(3)样本提取溶液配制，0.1mol/L高氯酸，内含5μL内标溶液。用精密电子称先称Eppendorf管重量，取离焦组18只豚鼠（实验眼18眼，对照眼18眼）及空白对照组6只豚鼠（12眼）的冰冻视网膜、脉络膜及巩膜组织标本，每个标本作为一个样品，置入上述已称重的Eppendorf管内，再称出管加样品的重量,减去样品重量,即得到样品的湿重。样品称重后加入95μL 0.1mol/L高氯酸及5μL的内标溶液，在冰浴上超声匀浆，于2000r/min离心15min，取上清20μL进样分析。取水溶液,分别加入5羟色胺(5HT)2，5，40，400μg/L，按样品处理方法操作后，以5HT浓度为横坐标，以反应峰高值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。计算方法：根据标准品的色谱分析，参照标准品的峰高大小及所测样品的峰高大小进行比较，确定其含量。
统计学处理：采用均数差异t检验的方法对空白对照组与离焦实验组及离焦对照组之间5HT含量结果进行差异的显著性分析。采用SPSS11.4软件。
2结果
标准曲线结果表明，5HT浓度在5～100μg/L范围内有良好线性关系：r=0.9991（图1）。豚鼠正常眼中,视网膜、脉络膜、巩膜内均有5HT存在，其中脉络膜中含量最高，其次为巩膜及视网膜。离焦眼中，视网膜、脉络膜及巩膜内5HT含量均明显增加（P＜0.01）；实验组对照眼与空白对照组相比较无明显差异（P＞0.05，表1）。
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