【摘要】 研究532nm激光TsoⅢ级光斑光凝色素家兔视网膜后光凝斑组织形态改变的病理特征。方法：(1)18只色素家兔按光凝后观察时间1，3，7，14，21d及28d分为6组，每组3只。每只（双眼）用532nm激光TsoⅢ级光斑光凝色素家兔视网膜后极部30点532nm,450mW,100μm,0.05s）。(2)光凝后不同观察时间点行荧光素眼底血管造影（fluorescence fundus angiography，FFA）观察光凝斑FFA特点；取光凝区眼球壁制作标本,进行光镜和透射电镜观察并定量分析视网膜光凝斑大小、视网膜细胞存活率的动态变化。结果：(1) 荧光血管造影：光凝后3d，部分光凝斑为高荧光，荧光渗漏随时间延长逐步减轻，至光凝后14d，荧光渗漏基本消失。(2) 组织病理学检查：光凝斑区域视网膜各层组织细胞结构破坏；光凝斑周围光感受器细胞的凋亡或坏死和神经节细胞的损伤；继后色素上皮细胞、Müller细胞和成纤维细胞增生修复破坏区。(3)形态学定量指标：光凝后第1d视网膜光凝斑直径最大为116.4±9.6μm,比参照光斑（75μm）增大了55.2%，随后有下降的趋势，21d后为82.8±5.4μm趋于稳定。视网膜细胞存活率光凝后第1d最小为(29.5±4.2)%，随后有上升的趋势，21d为(48.2±4.4)%趋于稳定。结论： 视网膜光凝TsoⅢ级光斑会导致光凝斑周围视网膜感觉神经细胞的非选择性、扩展性损伤。
【关键词】 光凝固术 激光损伤 动物实验 兔 视网膜
0引言
视网膜光凝术是治疗眼底疾病的一种重要有效的手段，但临床研究发现部分患者术后可出现即刻或进展性视力下降，但其发生发展的机制不太清楚。为探讨激光视网膜损伤的发生发展机制，本研究用532nm激光以TsoⅢ级光斑[1]光凝色素家兔视网膜后极部，观察光凝术后视网膜组织形态的病理改变，为防治光凝副作用的研究提供实验基础。
1材料和方法
1.1材料
健康成年有色家兔18只，雌雄不限，体质量1.5～2.5kg，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供。使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。实验前经裂隙灯、眼底镜检查双眼无异常。双眼均为实验眼，依术后观察时间点1，3，7，14，21，28d分为6个亚组，每组3只。 仪器设备：532nm激光机:法国Quantel Medical SA公司的Viridis Twin型；北京航空航天大学设计的多功能真彩色病理图像分析系统:CMIAS 2000型；荧光素眼底血管造影仪:日本TOPCON公司TRC50Ex型；LKB公司11800修块机；8800超薄切片机；日立H600透射电镜。
1.2方法
1.2.1动物模型建立
复方托品酰胺眼液和100g/L新福林散瞳，肌注盐酸氯胺酮(50mg/kg)和地西泮(2.5mg/kg)麻醉后，5g/L丁卡因角膜表面麻醉放置三面镜，用532nm激光机在视盘下方1～2DD击射30点。激光击射参数:光斑直径100μm，功率0.45W，时间0.05s，光斑间距100μm；激光反应斑为Tso分级Ⅲ级[1]。荧光素眼底血管造影：(1)激光照射后3，7，14，21，28d各一次FFA检查。动物麻醉后立即于耳缘静脉内推注200g/L荧光素钠0.2mL，10min后拍摄荧光素造影照片。比较各时间亚组光凝斑荧光渗漏程度。(1) 荧光渗漏程度评判标准每一时间点观察180个光凝斑定高荧光斑为++++;光斑中心出现小的遮蔽荧光，周围荧光中度渗漏为+++;光斑中心区遮蔽荧光增强,周围荧光轻度渗漏为++ ;光斑中心区遮蔽荧光增强,周围可见透见荧光，边界清晰为+;光斑中心区遮蔽荧光，无透见荧光为0(图1)。
1.2.2病理学标本制作
光镜标本制作：于激光击射后不同时间段，用空气栓塞法处死动物，去除眼周软组织，下方缝线标记后置于40g/L的多聚甲醛中固定24h，去除眼前节，然后沿视神经旁开白1mm矢状剖开眼球，取包括激光斑的全层眼球壁组织，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋，制成3μm厚的连续石蜡切片，常规HE染色光镜下观察。电镜检查标本制作：取激光击射后1，3wk眼球和正常对照组眼球作电镜检查，去除眼前节，切取光凝部位的全层眼球壁组织，置入25g/L戊二醛前固定48h，通过解剖显微镜辨别激光点,将临近激光点的正常视网膜1mm×2mm组织条块以10g/L四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，连续半薄切片(片厚1μm)定位，超薄切片机切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电镜下观察。
1.2.3定量图像分析
应用北京航空航天大学设计的多功能真彩色病理图像分析系统(CMIAS2000型)进行图像分析,定标比例尺单位为微米。参照Solbegry等[2]的方法稍加改进，在200倍显微镜下，选每个视网膜光凝斑的最大直径剖面为一个视野,每个标本随机选5处视野。进行视网膜光凝斑的直径测量；高倍显微镜下计数视网膜细胞存活率，两人分别计数，取平均值。形态学定量指标的确定：（1）视网膜光凝斑的直径：200倍显微镜下，用多功能真彩色病理图像分析系统根据RPE改变和视网膜各层细胞变化确定每个激光损伤灶的边界，从边界垂直色素上皮层作两条从RPE到GCL直线，两直线中点之间的距离为视网膜光凝斑的直径（图2），计算机自动输出结果。（2）视网膜细胞存活率：为视网膜光凝斑范围内各层（RPE层除外）存活的细胞数和临近损伤灶与光凝斑相同范围健康组织存活细胞的比率。用多功能真彩色病理图像分析系统，先在200倍显微镜下根据RPE改变和视网膜各层细胞变化确定每个激光损伤灶的边界；再在高倍显微镜下计数，两人分别计数，取平均值(图3)。
统计学处理：所有数据以SPSS12.0统计软件包进行处理，计量资料用±s表示，采用双因素方差分析，q检验进行两两比较，以P<0.05为统计上具有显著性差异。
2结果
2.1眼底检查及眼底血管荧光素造影
光凝后1d眼底激光斑呈灰白色水肿改变，中间有浓白色中心；光凝后7d激光斑中心呈灰色改变周围白色边缘，部分激光斑有水肿晕；光凝后14～28d激光斑呈黑灰色改变，水肿晕消失,且光凝斑之间有融合的趋势。光凝后3d，部分光凝斑为高荧光，其余的可见中心出现小的遮蔽荧光，周围荧光轻微渗漏；光凝后7d,荧光渗漏基本消失，中心区遮蔽荧光增强，周围可见透见荧光或荧光轻微渗漏；光凝后14～28d渗漏消失,中心区遮蔽荧光进一步增强。
2.2光凝斑荧光渗漏程度评判结果（表1） 表1激光损伤组不同时间光凝斑荧光素渗漏程度比较 (略)
其中++++、+++和0度者3～14d各时间组比较F=22.38 P<0.01,说明光凝斑荧光渗漏程度随时间逐步减轻, 14d趋于稳定。
2.3组织病理学检查
光镜下组织学改变：正常色素兔视网膜各层细胞完整、结构清晰，有色素上皮层（图4A）。光凝后 1d反应：视网膜激光损伤灶光镜下均为典型的小丘状形态破坏,杆锥体细胞层内外节结构紊乱或消失，ONL细胞可见凝固坏死、核崩解、碎裂；视网膜下间隙可见大量细胞碎屑;可见脉络膜血管扩张，血栓形成,白细胞浸润; RPE空泡变性或连续性中断;INL层和GCL较大的空泡水肿(图4B)。3d反应:外核层细胞移位、聚集、核深染，激光损伤区RPE缺失, ONL层减少或缺失,视网膜下间隙细胞碎屑减少，吞噬了色素的巨噬细胞已迁徙至视网膜内层，其余视网膜内层结构细胞排列紊乱。7d反应:视网膜下间隙细胞碎屑消失，由散在的成纤维细胞和胶质细胞出现于视网膜外层,病灶变薄,杆锥细胞层与外核层萎缩消失,含有色素的吞噬细胞迁徙至视网膜内层，特异性改变是RPE与杆锥细胞形成灶状粘连,而周围正常视网膜杆锥细胞层易与RPE分离(图4C)，偶可见视网膜内层组织(神经节细胞层和神经纤维层)的破坏。14～28d：RPE萎缩或增殖，杆锥细胞层和外核层细胞萎缩甚至消失，可见视网膜内层组织(神经节细胞层和神经纤维层)完好无损。电镜下超微结构改变：正常兔视网膜超微结构:视杆外节膜盘结构清晰,排列整齐,内节线粒体嵴连续,呈长圆形,神经节细胞、外核层细胞核排列紧密,染色均匀,形态规整(图5AC)。光凝斑周围正常视网膜超微结构可见：光凝后7d，部分感光细胞轻度核固缩,染色质集边,出现早期凋亡改变(图5D)。视杆外节膜盘轻度肿胀、模糊(图5E)；部分神经节细胞胞浆内线粒体嵴断裂,空泡变，内质网轻度扩张(图5F)。光凝后21d，感光细胞进一步核固缩,染色质集边，部分出现核碎裂，凋亡小体出现；部分神经节细胞胞浆内线粒体嵴断裂,空泡变，内质网轻中度扩张，细胞核改变不明显(图5G)。表2激光损伤组光凝斑直径和视网膜细胞存活率的动态变化（略）
2.4形态学定量指标测定
光凝后1,3d及1,2,3,4wk视网膜光凝斑直径和视网膜细胞存活率的动态变化(表2)。视网膜光凝斑直径光凝后1d最大为116.4±9.6μm（P<0.01），比参照光斑增大了54.6%，随后有下降的趋势，21d后趋于稳定。视网膜细胞存活率光凝后1d最小为（29.5±4.2）%（P<0.05），随后有上升的趋势21d为(48.2±4.4)%后趋于稳定。
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