2结果

    2.1大鼠RMEC培养及鉴定  原代RMEC可以结合4～6个磁珠(图2A)，其中以结合4个磁珠的常见，也可以看到结合更多磁珠的细胞条索。RMEC一般在24h内贴壁，48h完全牢固贴壁，72h可见细胞伸展，开始增生，呈现克隆样生长(图2B)，14d左右细胞克隆融合呈铺路石样外观。贴壁后细胞多数呈扁平梭形，也有少数细胞形态不规则，细胞长度约为磁珠直径20～30倍，宽度约为磁珠直径5～10倍。新生的细胞还可以结合培养液中游离的磁珠。细胞经历传代后(图2C)，磁珠可自然脱落，细胞形态较原代更加规则，传代周期缩短至9～12 d。RMEC第Ⅷ因子抗体染色阳性（图3A）。流式细胞仪检测样品抗PECAM-1阳性细胞（图3B）比例为97.1%。台盼兰染色活细胞率92%。

    2.2大鼠Müller细胞生长  大鼠Müller细胞在接种后24h内即可贴壁，第1次换液可将漂浮的和贴壁差的细胞洗掉，剩下的细胞多数为Müller细胞，可能混杂神经元细胞，原代细胞一般7～14d即可长满，按照1∶3方式传代，传代后细胞周期缩短至5～7d，经过2次传代后可获纯度相对较高的Müller细胞。细胞形态主要分为两种：一种胞体较

    大，不规则片状，折光性暗，胞质内原纤维较丰富，胞突的分支少而短（图4A）；另一种胞体较小，蜘蛛状，折光性强，胞突多而长（图4B）。Müller细胞进行GFAP（图5A）和vimentin荧光染色阳性（图5B）。分析对照组与Müller细胞共培养组RMEC生长曲线（图6），发现Müller细胞可以使RMEC提前进入生长平台期。培养5d，共培养组（n＝6）细胞数量为（8.5±3.8）×104，对照组（n＝6）为（3.2±1.4）×104，共培养组RMEC数量较对照组多（P＜0. 01, t＝3.206）。培养10d，共培养组（n＝6）细胞数量为（12.4±4.6）×104，对照组（n＝6）为（12.1±3.0）×104，Müller细胞共培养对RMEC融合期数量没有明显影响（P＞0.01,t ＝0.134）。

    A：游离细胞可结合4~6个磁珠，接种于明胶包被的培养皿中；B：6d贴壁血管内皮细胞；C：第5代培养8d，内皮细胞细胞融合

    图2 原代培养血管内皮细胞形态×100

    A：Ⅷ因子表达阳性；B：PECAM-1表达阳性

    图3 视网膜血管内皮细胞免疫组化染色×100

    A：不规则片状, 折光性暗，胞质内原纤维较丰富，胞突呈刺状分支；B：蜘蛛状Müller细胞，折光性强，胞质内原纤维较少，胞突多而长

    图4 Müller细胞形态×100

    A：GFAP表达阳性；B：vimentin表达阳性

    图5 Müller细胞免疫荧光染色×200

    图6 Müller细胞对RMEC生长曲线的影响

    2.3 RMEC细胞周期  由于细胞中DNA成分对于外界影响因子比较敏感，该实验采用无血清培养基尽量减少血清中各种生长调节因子的影响。由于Müller细胞存在使RMEC中S期和G2期比例增加，G1期比例相对减少（表1）。24h共培养组（S＋G2）％为55.2％，较无Müller细胞的对照组46.1％高。48h共培养组（S＋G2）％为53.1％，较无Müller细胞的对照组44.8％高。

    2.4迁移实验  传入微孔滤膜培养小室的内皮细胞与在培养板内相似，可很快贴壁生长。当下室无Müller细胞时，6h移行至膜下的内皮细胞3.3±2.5个，12h为14.7±7.0个。当下室有Müller细胞存在时，迁移的细胞数明显增加，6h移行至膜下的内皮细胞12.2±2.5个，12h为51.7±23.4个，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。在24 h时观察下室存在游离的细胞，多考虑RMEC迁移而入。

    3 讨论

     由于体内细胞研究受到限制，所以很多人进行视网膜微血管内皮细胞培养[15,16]。传统的组织块和消化培养方法对于可获得视网膜组织量非常少的大鼠RMEC来说非常困难。本实验采用阳性筛选法纯化RMEC，以小鼠抗大鼠PECAM-1单克隆抗体与包被有小鼠IgG的磁珠孵育，使之成为具有抗大鼠PECAM-1的免疫磁珠，与RMEC表面的PECAM-1结合形成细胞磁珠复合体，经过磁场作用与其他细胞分开。免疫磁珠的主要原理是利用包被的磁性微粒，特异性地与靶物质结合，使结合后的磁珠细胞复合体具有磁顺应性，在外加磁场的作用下，结合有靶物质的磁珠被滞留，从而与其他非磁性成分分离，达到纯化富集的作用，并被公认具有简便易行、分离纯度高、保留细胞活性等优点。我们分选出的细胞群，经流式细胞仪检测由磁珠分离法提纯的抗PECAM-1阳性细胞占细胞总数的97％以上。经台盼蓝染色观察，拒染率达92％，提示细胞活力未受明显影响，提纯的细胞可用于细胞生物学和分子生物学后续实验研究。虽然我们借助于MACS可以获得高纯度和高活性的RMEC，但是培养过程中也存在其他细胞污染的问题，其中主要是胶质细胞、周细胞、成纤维细胞。当污染细胞出现的时候，就需要及时处理。我们在培养过程中进行了几项必要的操作，进一步纯化RMEC，否则会影响内皮细胞的生长：当出现小范围的成纤维细胞时，采用机械除杂的方法及时清除；当污染细胞散在，机械除杂不再可行时，重复进行免疫磁珠纯化细胞步骤，或者根据污染细胞和RMEC贴壁时间差异来除杂。这些方法对于RMEC自身特性和活力没有太大的影响。

     Müller细胞培养是一项比较成熟的技术，可以采用的方法有组织块法、消化法等，经过后期自然生长和机械除杂方法可以获得纯度较高的细胞。细胞培养数代后，我们发现该细胞存在两种形态（图4），片状细胞多出现在细胞培养早期和融合期底层细胞中，而蜘蛛状细胞多出现在融合期上层细胞，偶尔也可以出现在早期。为了排除其它细胞混杂的可能性，进行PECAM-1、Ⅷ因子、α-actin等抗体染色，结果均成阴性。我们推测这种细胞的不同形态形成有两种可能：一是来源于视网膜部位不同，二是在生长过程中互相转化的。有人认为Müller细胞是存在于视网膜中特化的星形细胞，视网膜与脑组织存在部分相似的结构。脑组织中，根据星状胶质细胞的形态和分布部位不同可分成二种：一种是原浆性星状胶质细胞，分布在灰质内，胞体内原纤维较少，胞突的分支多而短；另一种是纤维性星状胶质细胞，分布在脑和脊髓白质内的神经纤维之间，胞突长而直，分支较少，细胞质内有丰富的原纤维[16-18]。这种特化的星形细胞能否像在大脑中一样具有两种形态呢？另有人认为Müller细胞具有部分祖细胞特性[19-20]，在视网膜中如何进一步分化，和不同微环境及代谢状态有关。目前这些相关Müller细胞研究尚在进行中。应用0.4μm微孔滤膜培养小室，进行Müller细胞与RMEC的联合培养，可以更接近体内视网膜内环境，模拟Müller细胞分泌因子对RMEC的作用。而使用8μm的微孔可允许内皮细胞穿过到达膜的下面，这些穿越迁移的内皮细胞可粘附于膜的下面，通过计数滤膜下面的细胞可基本反映细胞的迁移情况。

     我们发现Müller细胞可以加速RMEC生长至融合状态，生长过程中S期（DNA合成期）和G2期（生长后期）比例增加，说明Müller细胞可能分泌一些促进细胞生长的因子。此外在Müller细胞存在的培养环境中对RMEC有趋化迁移作用，这也证明该细胞分泌了一些趋化因子。在正常或缺氧环境中Müller细胞可以分泌多种细胞因子，RMEC受到这些因子正向或者负向调节，如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)-1、肝细胞生长因子(HGF) 和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)等可以促进RMEC生长，转化生长因子(TGF)-β、凝血酶敏感蛋白(TSP)-1 、色素上皮衍生因子(PEDF)等抑制RMEC生长。正相和负相调节因子稳态被打破是造成血管形成的根本原因[21,22]。我们培养过程中Müller细胞条件培养基促进RMEC增生和迁移，说明正向调节强于负向调节，有利于血管形成。本结果与Behzadian等[23]相反，他们进一步研究Müller细胞分泌TGF-β等因子抑制了RMEC生长。但Eichler等[24]和Beuckman等[25]实验结果发现Müller细胞分泌多种促进RMEC生长的因子，促进细胞增生和分化，我们实验结果与此部分相同。通过对文献回顾，我们也认为血管形成与否可能依赖于两种因子的平衡状态。

     致谢：德国洪堡基金会(Alexander von Humbo ldt Foundation)仪器设备捐赠基金(V-8151/02085)资助。

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