2结果

    2.1共培养系统中RMEC和RMGC的形态  RMGC接种在微孔滤膜上可于1h贴壁，至3h细胞贴壁牢固，6h开始增生，细胞多角形有较长的突起（图1A）。RMEC接种在微孔滤膜上3h开始贴壁，约6h贴壁牢固，24h开始增生，细胞成多角形或者梭形，3d细胞铺满90%，4d基本融合，单位面积内细胞继续增多，7d单位面积内细胞数量停止增加（图1B）。

    2.2微孔滤膜上细胞的超微结构  透射电镜图像显示RMEC在膜上呈单层生长，细胞内线粒体和内质网丰富，并有该细胞特异的Weibel-Palade小体，RMGC呈复层生长，细胞内有丰富的线粒体、糖原和微丝，细胞间隙较大，两种细胞均可有突起深入微孔中，但在样本中没有发现RMGC和RMEC间的连接。培养9d的模型切片中发现，相邻的RMEC胞膜紧密相连，没有缝隙（图1C）。

    图1A: 多角形微孔膜上的RMGC（bar: 100μm）;B:融合的RMEC;C:紧密连接结构

    2.3跨细胞电阻变化  跨细胞电阻（TER）可以间接的反映RMEC层的紧密连接的变化和屏障功能。图2显示在RMEC单层、RMGC层和共培养层的TER的变化情况。RMEC层TER在8d时达到最高，为（86.3±7.9）Ω·cm2。在有RMGC存在的共培养组TER 7d时为（97.6±3.6）Ω·cm2，约为7d时RMEC组的2倍，8d达到峰值（113.5±5.3）Ω·cm2。RMGC组TER值很低，波动在-5.7～15 Ω·cm2。在6～9d共培养组和RMEC单层的TER差异有统计学意义（P＜0.05）。RMEC单层和共培养层TER峰值约为 86Ω·cm2 和113Ω·cm2，此时细胞间紧密连接发育成熟，可用于进一步的通透性实验。

    图2 RMEC单层、RMGC层和共培养层TER的变化

    2.4细胞间的ZO-1表达变化  在RMEC生长至融合过程中，1d ZO-1在细胞质内表达，3d ZO-1在胞核内强荧光表达，胞质和细胞边缘弱荧光表达，7d细胞边缘荧光增强，胞核和胞质中荧光强度明显减弱。在与RMGC共培养时，RMEC ZO-1表达要强于同时的RMEC单层（图3）。蛋白半定量显示整个培养过程中ZO-1表达随培养时间延长逐渐增强（图4）。

    A,C,E: RMEC单独培养1,3,7d；B,D,F: RMEC共培养1,3,7d

    图3  RMEC与RMGC共培养组和RMEC单独培养组ZO-1在细胞中表达部位变化。各时间点两组RMEC均有ZO-1的表达，在1d ZO-1主要表达在细胞质中，3d ZO-1表达在细胞质、细胞核以及细胞膜上，细胞核内染色较强，细胞膜上表达较弱，7d ZO-1主要表达在细胞间隙和胞膜上，细胞核及细胞质中表达极弱

    图4  共培养组和RMEC组中RMEC ZO-1蛋白表达变化 aP<0.05 vs  RMEC; vs 3, 5d

    3讨论

     建立接近生物体功能的iBRB模型，首先是要获得高纯度的RMEC和Müller细胞，既往的国内外iBRB模型研究中RMEC来源主要是牛[7]和猪[8]，而且纯度不一，或是采用某种内皮细胞系，如ECV304 [9]和TR-iBRB2 [5, 10]等，由于纯度和细胞特性改变，会造成所建的模型和体内屏障通透性偏差较大。由于正常大鼠视网膜可提供的RMEC数量较少，并且有多种易混杂的细胞，所以要获得高纯度的RMEC有较大困难[11]。采用前面所描述的免疫磁珠结合的方法培养出高纯度的大鼠来源RMEC，为iBRB模型的建立提供了良好细胞来源。常用微孔膜有0.4μm和3μm两种常用孔径[12]，对于0.4μm孔径的微孔膜选择我们基于2种考虑：①前期研究证实部分内皮细胞胞体可以穿过3μm微孔，迁移到背侧；②我们的预实验研究发现RMEC在3μm的微孔膜上形成的屏障TER值远低于0.4μm微孔膜，可能是由于细胞与微孔贴附的紧密程度有关，如果贴附不紧密，会造成相当于细胞外间隙的空间增大，会造成大量离子的流动，导致TER降低。

     对于通透性测定有两种常用方法，一种是TER测量，另一种是对于不同分子量的物质通透系数的测量，TER是一种间接体现屏障功能的方法，一般来说，成熟的模型中大动脉内皮TER＞微血管内皮TER＞静脉内皮TER，我们的模型TER结果与部分研究报道的TER结果一致，Tretiach等[4]报道通过牛的RMEC和RMGC建立模型的TER值为70Ω·cm2，但Gillies等[12]报道TER值高于400Ω·cm2，我们认为这主要是细胞来源不同造成的。TER的大小可作为内皮细胞在损伤因子作用下的通透性发生改变的难易程度，例如RMEC的TER为100Ω·cm2左右，而脑微血管内皮细胞的TER＞400Ω·cm2，所以糖尿病患者更易发生视网膜微血管病变。此外，我们培养的RMEC还存在聚集特性，细胞消化后，往往不能完全成为单细胞悬液，而是聚集成细胞团存在，这可能与细胞表面存在的某些黏附分子有关，在用吸管吹打数十次后，还有部分细胞团存在，如一个细胞团接种于膜上，不是细胞团中所有的细胞都会存活和伸展，再培养数天后，局部会出现“破孔”，可能会导致TER值的下降。在细胞接种后12d左右，部分细胞活力下降，不能继续贴壁，会导致模型的屏障功能下降，此时TER＜30Ω·cm2，不宜继续进行实验。

     ZO-1是膜相关的鸟苷酸激酶家族的成员之一，并介导细胞间接触位点的信号转导。我们在本实验中发现在模型屏障功能形成之前，有一段时间会在细胞核中表达，在融合之后表达在细胞膜上。这与Gottardi等[13]研究结果一致，他们认为在融合前，细胞间接触没有完全形成，此时膜相关的鸟苷酸激酶产生信号，核内转录作用加强，造成核内ZO-1的一过性堆积。

     许多研究表明，RMGC在RMEC由非屏障细胞向屏障细胞转变的诱导和维持中扮演着积极的角色。在血脑屏障中，应用星形细胞特有的胶质纤维酸性蛋白和谷氨酸合成酶抗体标记定位分析的一系列研究发现：星形胶质细胞能促进毛细血管内皮细胞膜上多种酶活性的增强，并能明显促进内皮细胞间紧密连接的数量、长度及连接复合体的增多[14]。我们也证实，RMGC能加强RMEC的屏障功能。具体表现在同一时间点共培养RMEC层的TER值高于独立RMEC层，ZO-1的表达也高于独立RMEC层。RMGC作为iBRB 的重要成分, 除了在屏障的诱导生成和形态维持上发挥重要作用，还能够释放多种化学成分短时间内调节内皮细胞的通透性。在内皮分化和诱导的过程中, RMGC胞外基质起到了很重要的调节作用，TGF-β，GDNF，bFGF，IL-6 和一些类固醇物质参与了这一过程[15]。Igarashi 等[16]利用免疫组化法在GFAP 阳性的细胞中检测到GDNF (胶质细胞源性神经营养因子)，NTN(neurturin)及二者的受体( GFRα1 及GFRα2)，这两种营养因子均可增强RMEC的屏障功能，调节BRB的通透性。所以目前认为RMGC可能是诱导血管内皮间紧密连接和维持iBRB 的结构基础。

     RMGC和RMEC在微孔膜的两侧能否存在形态上的直接联系呢？模拟血脑屏障的研究中，有人将两种细胞培养在生长膜的不同侧，发现胶质细胞可以伸出伪足与毛细血管内皮细胞形成玫瑰花结样结构联系[17]。我们在本实验中没有找到产生直接的联系的依据。此外，在这种RMGC和RMEC三维培养模型中，RMGC可以诱导RMEC相互间形成紧密连接，并有紧密连接蛋白表达和高TER等特征，但是在体内，BRB的两侧液体成分是不同的，包括蛋白质和离子浓度不同，而且还具有细胞的极性[18]，而我们的BRB模型中细胞两侧的液体是相同的，并且缺乏细胞极性，所以，该模型只具有部分屏障功能，只适合于一些物质通透性的研究。

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