3讨论

     角膜在正常生理状态下是没有血管的，但是各种导致角膜缘屏障破坏的病因都可以诱导角膜新生血管化[1]。角膜新生血管化不仅是致盲的重要原因之一，亦是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。新生血管化的植床既能增加术后的排斥反应率，又降低植片的存活率，并且新生血管的数量与术后排斥反应率呈正相关。因此采取有效措施抑制角膜新生血管的形成和生长，是减少角膜移植排斥的重要措施之一[4,5]。我们首先建立起兔角膜新生血管的模型。在以往研究中建立角膜新生血管模型的方法较多。常用的有酸碱化学烧灼法，这种方法取材简单、操作方便，可以良好地诱导出角膜新生血管，并且角膜新生血管的形成、生长情况确切；但存在有烧灼范围、烧灼深度等方面不易控制的问题[6]。另一种较为常用的方法是角膜微袋内植入化学颗粒来诱导新生血管，这种方法诱导出的新生血管生长定向性好，个体间差异性小；但存在使用的器械特殊、药物配制及包埋过程较为复杂等不利因素 [7]。我们采用角膜缝线法建立角膜新生血管模型。与以上两种方法比较，诱导的新生血管形成理想，且在形成时间、生长速度、生长方向等方面个体间差异小，易于比较，同时材料简单，操作容易[8]。在本实验研究中以PBS组结果作为模型的参照，此组诱导出的兔角膜新生血管与Holzer等[9]研究结果类似，且个体间差异性较小。因此本研究中对所建立的角膜新生血管模型评价是满意的。

     由于目前研究已证实角膜新生血管形成步骤与其他部位新生血管的形成是类似的，都表现为血管基底膜的降解、内皮细胞增殖致新生血管芽的形成、分支，新生血管腔的形成，直至血管成熟细胞的形成，所以针对抑制新生血管生成的研究也是作用于不同阶段。近年来研究发现纤溶酶原的降解片段具有强大的抑制新生血管形成作用，其最早是由O’Reilly等从Lewis肺癌小鼠的尿、血清中分离得到，而K1-5蛋白作为纤溶酶原的一个55ku降解片段，包含着纤溶酶原完整的K1-4和大部分K5片断[10]。同时有研究发现K1-5可特异地抑制处于增殖状态的血管内皮细胞并诱导内皮细胞的凋亡，来发挥强大的抑制新生血管的作用，并且发现其不影响静止的内皮细胞或非内皮起源的细胞[10,11]。也有研究认为K1-5还可通过干预整合素αvβ3介导的信号传导来抑制新生血管生成[12]。我们将人的K1-5蛋白配制成1.5mg/L眼液应用于缝线法诱导的兔角膜新生血管模型中，结果发现，K1-5组角膜新生血管出现时间晚于PBS组（二者之差为1.40±0.31d）；K1-5组角膜新生血管生长高峰在9～15d，而PBS组则在4～10d；在整个新生血管生长过程中K1-5组的新生血管长度、面积均明显小于PBS组。由以上结果可以得出局部使用K1-5滴眼液可通过延缓角膜新生血管的形成时间及其生长高峰，并减小新生血管长度、面积来发挥其抑制角膜新生血管的作用。这一结果与Cao等[2]使用2～2.5mg/L K1-5的抑制角膜新生血管效果基本一致。由此可证实局部使用1.5mg/L K1-5蛋白能够抑制兔角膜新生血管的形成、生长。我们分别在不同时段（5，10，20d）对角膜组织进行HE染色，可以观察到各个时段里K1-5组角膜组织中缝线及新生血管周围各种炎症细胞（主要为浆细胞、淋巴细胞等）较少，其炎症反应较轻；而PBS组炎症细胞较多，其炎症反应较重。据此可推测出K1-5具有抑制角膜局部炎症反应的效果，而这一结果在以往文献中较少报道[11,13]。由此可提示我们K1-5亦可能是一种抗炎剂或在一定程度上能够抑制炎症反应，通过减轻由物理因素引起的局部炎症反应，减少相关炎症因子的表达，也就减弱了相应新生血管刺激性因素的作用，从而发挥出抑制新生血管的功能。但也不能排除是因为K1-5抑制了角膜新生血管的形成、生长，减少了来自新生血管中各种炎症细胞的聚集，所以在局部就表现为相对轻的炎症反应。由于本实验研究的限制，对于K1-5究竟有无抗炎功能及其可能的作用机制还需要进一步研究来明确。

     现有研究已发现，在新生血管的形成过程有两大类因子共同发挥调控作用：一些细胞因子具有促进作用，如VEGF、bFGF等；另一些则是抗血管生成因子，如angiostatin，endostatin等[14,15]。在促新生血管因子中，血管内皮生长因子（VEGF）的作用已得到明确证实，首次是由Senger等在1983年分离出，目前研究已发现VEGF实际上是一类34～45ku糖蛋白二聚合物，其中高剂量的VEGF121能显著地增加新生血管的直径，这一过程可能是通过 MEK1-ERK1/2 信号来进行的，进而引起内皮细胞的增殖及迁移[16]。我们运用VEGF121进行免疫组织化学染色，结果发现在不同时段里，K1-5组角膜新生血管内皮细胞中VEGF121的阳性表达均明显少于PBS组，同时发现两组中VEGF121阳性表达强度均是与角膜新生血管长度、面积的变化一致。其中PBS组VEGF 121阳性表达情况与Nakatsu等[17]以及Castro等[18]研究结果相近。根据本研究结果结合目前对K1-5作用机制的研究，推测出K1-5可能是通过诱导血管内皮细胞的调亡，干预整合素αvβ3介导的信号传导来抑制血管内皮细胞的各种活性功能，从而使VEGF的表达受到抑制，同时也减弱了VEGF与新生血管内皮细胞相应受体的结合，使得VEGF难以发挥出其强大的诱导新生血管作用，结果表现为角膜新生血管的形成及生长受到抑制。

     此外，我们还观察到K1-5组角膜新生血管未能受到完全抑制，分析其原因可能为：①K1-5蛋白配成眼液后，本身存在有蛋白质自身代谢问题，随着药物的自身代谢，其强大的作用效果就会受到影响。②已往研究资料中K1-5 在体外实验结果是理想的，眼结膜下注射也有较好效果，但局部点眼报道较少，因此K1-5眼液的前房渗透力尚不能明确。③由于研究已证实新生血管的形成涉及诸多因素步骤，因此采取单一措施往往只能在一定程度上抑制新生血管的形成和生长，并不能完全抑制新生血管。④我们采用人的K1-5蛋白，应用于兔是否可能存在种属之间的差异性尚不清楚，由此也可能影响其在研究中的抑制效果。

     总之，人K1-5 蛋白滴眼液作为一种新型的新生血管抑制因子是能够抑制兔角膜新生血管的形成及生长，并能在一定程度上减弱局部炎症反应。研究结果能够提示我们K1-5蛋白滴眼液在抑制角膜新生血管方面是有着较好的应用前景，但由于本实验研究存在的局限性，因此对K1-5蛋白抑制角膜新生血管的作用途径、作用效果以及毒副反应等方面仍需要进一步深入研究加以证实。

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17 Nakatsu MN, Sainson RC, Perez-del-Pulgar S, Aoto JN, Aitkenhead M, Taylor KL, Carpenter PM, Hughes CC.VEGF(121) and VEGF(165) regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Lab Invest ,2003;83(12):1873-1885

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