【摘要】 目的：为了利用流产儿角膜组织体外培养获取角膜上皮细胞，做为构建组织工程化角膜上皮的种子细胞。方法：收集30例（60个角膜）人流产胎儿，分别采用酶消化法、酶消化法结合组织块法和组织块法3种方法分离并培养人胎儿角膜上皮细胞。结果：用Dispase和胰蛋白酶冷消化角膜上皮后，在获取细胞总数、细胞活力和原代培养成功率上没有明显差异，但用Dispase消化后原代细胞容易成活，传代可得到纯化的上皮细胞；酶消化法结合组织块法培养时加入角膜缘组织块可以缩短细胞形成单层的时间，增加传代后细胞的活力；组织块法培养时，在胎儿全角膜组织培养时可得到角膜上皮细胞，角膜组织切割后培养不能获得纯化的角膜上皮细胞。结论：体外构建组织工程化角膜上皮时，种子细胞的获取可以采用流产儿角膜组织为材料分离并培养角膜上皮细胞。
【关键词】 人胎儿；角膜细胞；分离；培养
Study on isolation method of cornea epithelial cells from human fetus
Lei Qu, XiaoQi Jing, HaiLong Yan, ZhongYing Dou
Foundation items: National Natural Science Foundation of China (No.39970363); National Key Basic Research Development Program of China (No.G1999054300)
1Life Science Research Center, Yulin University, Yulin 719000, Shaanxi Province, China;
2Shaanxi Stem Cell Engineering Research Center, Northwest SciTech University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100, Shaanxi Province, China
Abstract AIM: To accumulate experiment data for isolation and culture of human corneal epithelial cells from abortive fetus and construction of tissue engineered corneas.METHODS: Human corneal epithelial cells was isolated and cultivated from 30 abortive fetus (60 corneas) in vitro by enzyme digestion, tissue block method and tissueblock digested with enzyme method.RESULTS: The results showed total cells, cell vitality and success rates of primary culture were not significantly different between Dispase and tripsin digestion, whereas the survival of primary cells digested with Dispase were easier contrast to tripsin and could obtain pure corneal epithelial cells. Monolayer forming time was shorten and vitality of passage cell was increased in tissueblock digested with enzyme method. Human pure corneal epithelial cells could be obtained when wholecorneas were cultured, but not when corneas tissue incised.CONCLUSION: Human abortive fetus cornea can use as experimental material to isolate and culture human corneal epithelial cells.
KEYWORDS: abortive fetus; corneal cells; isolate; cultivate
0引言
体外分离和培养成人角膜上皮细胞[1]和诱导骨髓间质干细胞横向分化为角膜上皮细胞[2，3]，可为体外构建组织工程角膜上皮提供种子细胞。实际上，人胎儿角膜上皮细胞的增殖和分化潜能更大，并且胎儿期的免疫系统尚未发育完全，存在免疫赦免现象[4]，培养胎儿角膜上皮细胞构建组织工程角膜上皮，在同种异体移植时，免疫反应将更弱。为此，本研究收集30例（共60个角膜）人流产胎儿，分别采用酶消化法、酶消化法结合组织块法和组织块法3种方法分离并培养人胎儿角膜上皮细胞，为采用流产儿角膜组织分离角膜上皮细胞并构建组织工程化角膜上皮的研究积累实验资料。
1材料和方法
1.1材料
DMEM/F12培养基和牛胰岛素(Gibco公司)，胰蛋白酶、明胶和EDTA(sigma公司)，小牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所产品），葡萄糖、抗生素为国产分析纯。CO2培养箱（LAB 2300美国）、倒置相差显微镜（Leica公司）、解剖显微镜和六孔细胞培养板等。角膜上皮细胞培养液和消化液：（1）DMEM/F12(1∶1)基础培养液，内含15 mmol/L HEPES，添加200 mL/L胎牛血清，1×104ng/L EGF，5×103μg/L胰岛素，5g/L DMSO，0.5×103μg/L氢化可的松，100×103 U/L青霉素，100mg/L链霉素，pH 7.0～7.2。（2）2.5g/L胰蛋白酶消化液，称取0.25 g胰蛋白酶，0.02g EDTA和0.1g葡萄糖溶于100mLPBS（－）溶液中，溶解后用0.22 μm孔径滤膜过滤、分装，20℃冷冻保存备用。（3）1.2 U/mL Dispase酶消化液，原装0.78U/mg，称取0.153g Dispase溶于100mL PBS（－）溶液中，配成1.2U/mL的Dispase酶消化液，磁力搅拌溶解后，0.22μm孔径滤膜过滤、分装，20℃冷冻保存备用。胎儿角膜的处理：胎儿取自流产或本人要求人工流产的无传染病等的健康孕妇，均为死胎，标本均征得孕妇本人和医院双方同意并记录胎儿胎龄，共收集30例流产胎儿，其中4～6月龄20例，7～9月龄10例，共计60个角膜用于实验。将流产后的胎儿及时带回实验室，一般不超过6h。用1000U×103/L青霉素，1g/L链霉素的生理盐水反复清洗胎儿体表污物和血凝块后，带入无菌室。眼部皮肤用750mL/L乙醇棉球擦洗消毒后，用无菌手术器械，打开眼睑，剪掉上下眼睑，摘除眼球，放入双抗PBS（－）的容器中30 min后，剪掉多余的肌肉和结膜，再放入自制的固定胎儿眼球的装置中，从角膜缘外1mm处取下全层角膜，剔除晶状体和虹膜，置无菌平皿中备用。
1.2方法
原代角膜上皮细胞的分离与培养，设计3种方法分离角膜上皮细胞：酶消化法，共10例20个4～6月龄角膜，每例2个角膜用角膜剪在体视显微镜下，板层剪取每个角膜缘和角膜上皮组织，分别置1.2 U/mL Dispase酶和2.5g/L胰蛋白酶消化液中，4℃冷消化12～14h，加入培养液中止消化后，用角膜剪背侧轻轻刮下已消化的上皮细胞，并用吸管吹打离散细胞，1000rpm离心5min收集细胞，弃上清液后，重新加入培养液1mL制成细胞悬液。血球计数板计数细胞总数，10g/L台盼蓝染色计数活细胞数，制成约1×105个活细胞/mL浓度，取0.5mL加入六孔板中培养。酶消化结合组织块法， 10例7～9月龄，在体视显微镜下，每个角膜板层分离角膜缘和角膜上皮后，置1.2U/mL dispase酶中，4℃冷消化12～14h后，与酶消化法相同的处理程序，经血球计数板计数细胞总数，10g/L台盼蓝染色计数活细胞数，并记录不同胎龄角膜获取的细胞总数和活细胞数后，制成约1×105个活细胞/mL浓度的细胞悬液。同时将已去上皮的角膜缘组织剪成约1mm2大小的组织块，取5～6块置于六孔板中室温干燥30min后，将细胞悬液0.5mL小心加在角膜缘组织块的周围培养，同时取0.5mL细胞悬液加入无组织块的六孔板中培养做为对照。组织块法，剩余10例角膜，在体视显微镜下，将其中的5例10个角膜，每个角膜切成4个相同大小的组织块，将角膜组织块上皮面向上放入六孔板中。另外5例10个角膜，将每例胎儿的2个完整角膜上皮面向上，置入六孔板中。无论是角膜组织块还是完整角膜，放入六孔板后，先加入100μL胎牛血清干燥1h，再加少量角膜上皮细胞培养液，24h后待角膜完全固定于培养板底，再加入2mL培养液培养。记录从每个角膜组织块或完整角膜长出角膜上皮细胞的时间。上述原代培养成功的角膜上皮细胞，用2.5g/L胰蛋白酶37℃消化5min，离散细胞，以约1×105个细胞/mL浓度传代培养。细胞培养在培养板上，每天倒置镜下观察记录细胞形态和生长情况，细胞呈多角形或圆形生长的为上皮细胞，适时传代；细胞呈索形或纺锤形生长的为成纤维细胞，放弃培养。
2结果
用Dispase和胰蛋白酶冷消化角膜上皮后，在获取细胞总数、细胞活力和原代培养成功率上没有明显差异（表1）。但用Dispase消化后的细胞10例中有5例原代培养成功，并可传代；而胰蛋白酶消化后的细胞4例原代培养成功且只传至第3代，细胞就开始衰老或出现成纤维细胞污染，不能继续传代。培养的人胎儿角膜上皮细胞倒置显微镜观察，无论是原代或传代细胞，均出现典型的角膜上皮细胞“拉网”生长的现象（图1）。传代培养时，培养2～4h后，就可见一部分小圆细胞贴壁生长，24h后从细胞胞体伸出突起，相互连接成网状。继续培养出现多角形细胞，培养72h后，细胞连接成膜片状单层，细胞形态保持不变，出现聚集成团的细胞克隆，须及时传代扩增培养，现已传至第10代。酶消化结合组织块法，细胞在6孔板中培养24h后，发现有部分细胞或细胞团块贴壁生长，加有组织块对细胞贴壁没有明显影响，在添加组织块的培养皿中，原代培养7d左右细胞就可长满皿底，细胞呈多角形或圆形，细胞长满皿底后及时清除组织块，传代培养没发现有成纤维细胞污染，现已传至第10代冻存。在不加组织块的培养皿中，细胞贴壁生长，呈多角形或圆形的上皮细胞形态，形成小片状细胞膜片，与添加组织块相比，原代培养细胞生长缓慢，约需10d左右才能长满皿底，时间明显延长。比较用Dispase消化后的4～6月龄和7～9月龄角膜获取的上皮细胞数与活细胞百分率后发现，4～6月龄胎儿角膜在获得的上皮细胞总数和活细胞百分率上显著低于7～9月龄的胎儿角膜（表2）。对角膜组织块和全角膜组织培养，采用全角膜贴壁培养比角膜组织块培养更容易获得角膜上皮细胞（分别为8/10和2/10），并且全角膜培养在第3 d就可见到细胞从角膜边缘长出，细胞均呈典型的多角形上皮细胞形态，且出现明显的“洋葱皮样”生长现象（图2），传代培养时这种“洋葱皮样”现象消失。角膜组织块培养时，在7～9d才长出细胞，并且为短梭形的成纤维细胞，未能获得角膜上皮细胞。表1 不同消化酶对分离角膜缘上皮细胞的影响（略）表2 不同胎龄角膜获取的上皮细胞数与活细胞百分率比较（略）
[1] [2] 下一页 |
