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3讨论
根据现有资料，国外有关人胎儿角膜细胞培养的研究多集中在上个世纪八十年代中期[5，6]。Hyldahl曾对8周龄人胚胎角膜细胞进行原代培养，认为8周龄人胎儿角膜已发育为上皮层、基质层和内皮层，可以体外培养扩增培养角膜上皮细胞，也有研究发现，胎儿角膜上皮在4mo时形成2～3层细胞，细胞界限不清，表层细胞稍扁平、核扁圆，深层细胞低柱状，核椭圆，6mo增至3～4层，8mo为3～5层[7]。说明随着胎儿胎龄的增加，角膜上皮细胞总数也在增加，为此，我们收集最早4月龄的人流产胎儿分离角膜上皮细胞，并在用1.2 U/mL Dispase酶和2.5g/L胰蛋白酶消化液均可原代或传代均可获得角膜上皮细胞。我们也发现用Dispase酶消化7～9月龄胎儿较4～6月龄胎儿可获得更多的离散细胞，同时对酶消化的耐受性也增加，活细胞数也多，差异显著(表2)。我们认为，人胎儿角膜上皮分离时不宜采用胰蛋白酶消化法，此法获取的细胞混杂有较多的成纤维细胞，不利于上皮细胞的纯化培养；这一结果似乎与易敬林等[8]的结果不同，可能是研究中所用胎儿的胎龄不同所致。直接消化获取较纯的角膜上皮细胞最好采用Dispase冷消化法。Koizumi等[9]用Dispase酶消化角膜缘组织后发现，Dispase酶可以完整地将角膜缘上皮从上皮基底膜上消化下来，与胰蛋白酶相比，可以获得更多的角膜上皮细胞，通过比较这两种酶的消化效果后，可以看出这两种酶对获取细胞总数和细胞活力没有影响，但是用Dispase酶消化后细胞传代次数明显增加，说明其消化后可获得更多增殖能力强的细胞，角膜上皮细胞培养用Dispase冷消化，消化效果好，值得推广。崔彦等[10]发现将消化后的组织块与消化细胞一起培养，细胞易于成活，形成细胞膜片时间短，我们的结果与此相一致，在不加组织块培养时，细胞膜片容易脱离皿底而死亡，且形成细胞膜片时间长；在加有组织块的培养中，虽然形成细胞膜片时间缩短，但应在原代培养结束之前及时将组织块清除出去，否则获得的传代细胞时会造成成纤维细胞的污染，不利于获取纯化的角膜上皮细胞。在组织块培养法中，将角膜组织切成小块培养，我们没能获得上皮细胞，但是，组织块贴附皿底经7～9d培养后，从组织块边缘可长出梭形的成纤维细胞。可能原因是角膜上皮细胞经剪切等处理过程，或者被丢失，或者用金属器械切割后不利于上皮细胞从组织块中移出。而全角膜直接培养可以克服上述弊端，值得一提的是，在本实验的条件下，采用全角膜组织贴壁培养时，3d后就能长出细胞，以多角形细胞出现居多，并且在4～5d之内细胞就能成膜片状向外推开，达密集生长状态；若角膜贴壁7～9d后才能长出细胞，大多数以梭形的成纤维细胞为主，这种上皮细胞先于成纤维细胞长出的机制，有待进一步研究。在构建组织工程角膜上皮时，种子细胞最好是来源于角膜缘的角膜缘干细胞，Rodrigues等[11]在 研究发育的人胎儿角膜上皮细胞的角蛋白CK3的表达模式时，发现在妊娠后第8wk，角膜上皮仅有一层细胞所构成，CK3染色阴性。妊娠后12～13wk，有3～4层细胞，并且表层细胞开始表现CK3阳性，开始了角膜表型的分化，在36wk所有的角膜上皮明显在形态上开始成熟，在角膜缘和角膜上皮的基底层都有CK3的表达，这些结果也提示了一个有意义的可能性，即所有的角膜和角膜缘基底层细胞起初都是干细胞。后来在中央角膜的基底层细胞逐渐随着基底膜的成熟开始了CK3标志的表达，这样在已成熟的角膜，仅角膜缘基底细胞仍然保持干细胞的特性，所以在分离培养人胎儿角膜上皮时，选择那些胎龄小的胎儿分离到角膜缘干细胞的可能性增加。另外，Wolosin等[12]研究表明，角膜缘干细胞缺乏Cx43（connexin 43），结合Matic等[13]的研究，提示这种缺乏间隙连结可能正是干细胞“巢”得以保持的原因，可使干细胞与已分化的细胞分割开，他们认为Cx43阴性细胞可能是干细胞的前体细胞，也提示我们，对那些在胚胎发育过程中调节角膜上皮分化的外界因素研究，是将来准确分离角膜缘干细胞时值得重点关注的内容。
【参考文献】
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4 Guller S, la Chapelle L. The role of placental Fas ligand in maintaining immune privilege at maternalfetal interfaces. Semin Reprod 1999;17(1):3944
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6 Hyldahl L. Control of cell proliferation in the human embryonic cornea: an autoradiographic analysis of the effect of growth factors on DNA synthesis in eddothelial and stromal cells in organ culture and after explantation in vitro. J Cell Sci1986;83:121
7林卡莉，周小龙，钟瑞冲，等.胎儿与成人角膜组织学比较及其意义.中国临床解剖学杂志 2002； 20（2）：147149
8易敬林，钟文贤.胎儿角膜缘干细胞的培养和生物学特性观察.眼科研究 2005；23（5）：465467
9 Koizumi N,Cooper LJ,Fullwood NJ, et al. Evaluation of cultivated corneal limbal epithelial cell, using cellsuspension culture. Invest Ophthalmol Vis Sci2002;43:21142121
10崔彦，董晓光，谢立信,等.人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别.眼科新进展 2001；21（4）：231234
11 Rodrigues M, BenZvi A, Krachmer J, et al. Suprabasal expression of a 64kilodalton keratin in developing human corneal epithelium. Differentiation 1987;34(1):6067
12 Wolosin JM, Schutte M, Zieske JD, et al. Changes in connexin 43 in early ocular surface development. curr Eye Res 2002;24:430438
13 Matic M, Petrov IN, Chen S, et al. Stem cell of the corneal epithelium lack connexins and metabolite transfer capacity. Differentiation1997;61:251260
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