眼科病理             2717                                      AB1101

    大鼠BDNF基因克隆和重组逆转录病毒pLXSN-BDNF的构建及包装

    邵正波1  原慧萍1 吴东来2 周欣荣1 李鸿翼1

    哈尔滨医科大学附属第二医院眼科    150086

    目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子基因（BDNF）并构建含BDNF基因片段的真核表达载体pLXSN-BDNF，在体外进行包装，以获得稳定的产毒细胞株，对BDNF基因治疗视神经损伤进行了初步探索，为今后研究神经营养因子在视神经保护中的应用奠定基础。

    方法 提取大鼠海马组织的总RNA，逆转录合成cDNA第一链，以其为模板扩增目的基因BDNF。将目的DNA片段和pMD18-T Simple克隆载体连接，转化至E.coli感受态JM109中，选取阳性菌落提取质粒后测序鉴定。以pMD-BDNF为模板扩增BDNF基因片段，EcoR I和Xho I双酶切BDNF和 pLXSN，再将BDNF基因和pLXSN的酶切产物连接成pLXSN-BDNF。筛选重组子，送测序。转染PA317细胞系，对重组质粒进行包装，用G418进行筛选。通过PCR和RT-PCR的方法分别对产毒细胞株和病毒上清液进行检测。

    结果 将扩增的BDNF基因片段克隆入pMD18-T Simple载体，获得阳性克隆pMD-BDNF，测序鉴定与已知序列相符。取测序正确后将BDNF基因亚克隆入逆转录载体pLXSN，得到重组质粒pLXSN-BDNF。经过PCR、酶切和测序鉴定，所克隆的BDNF基因序列正确，克隆的BDNF基因已经正确插入到逆转录病毒载体pLXSN中。通过对病毒的包装筛选及PCR和RT-PCR技术鉴定，细胞基因组中已整合入BDNF基因，包装细胞PA317可以分泌重组的逆转录病毒。

    结论 本实验成功克隆了大鼠的BDNF基因，并构建了重组的真核表达质粒pLXSN-BDNF，通过病毒包装，获得了稳定的产毒细胞株。pLXSN-BDNF病毒的获得为今后感染神经干细胞，探索以神经干细胞作为基因工程细胞，促进神经元再生和修复，对神经损伤性疾病开展基因治疗的可行性研究奠定了实验基础。

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