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2结果
2.1光镜观察 RGCL层凋亡细胞的观察：光镜下正常组RGCL细胞形态基本正常，组2,3,4的RGCL内可见个别细胞呈现凋亡形态，凋亡细胞表现为细胞体积缩小，染色质致密聚集成斑块状。
2.2 TUNEL染色 4个组每个眼球随机抽取两张切片经TUNEL技术染色后，在光学显微镜下见RGCL部分细胞的细胞核呈棕黄色颗粒，即阳性细胞(图1A～D)。组1，2，3，4平均每个眼球切片的阳性细胞数分别是1.11，9.60，3.60，9.50，其差异有统计学意义(P=0.000)，单纯给氧组较正常组凋亡阳性细胞数显著增多(P=0.000)，雌二醇干预组显著少于单纯给氧组(P=0.000)和植物油给氧组(P=0.000)，植物油组与单纯高氧组之间没有统计学差异(P=0.999)。
2.3免疫组化结果 正常组(图2A)17天龄大鼠iNOS在视网膜各层几乎没有表达，高氧组(图2B)和植物油组(图2D)在视网膜各层呈强阳性表达，雌二醇干预组(图2C)呈弱阳性表达，主要位于神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层以及外丛状层。对各组iNOS的免疫反应程度A测定结果为：正常组2033±1177，单纯高氧组5692±3863，雌二醇干预组2291±1303，高氧溶媒组5143±2395，正常组iNOS表达与单纯高氧组有统计学差异(P=0.014)，雌二醇干预组与高氧对照组具有显著统计学差异(P=0.017)，溶媒组与高氧组的差异没有统计学意义(P=0.682)。
3讨论
1980年以后，随着医疗护理技术的不断提高及新生儿重症监护病房(NICU)的建立，早产儿的存活率随之不断提高。早产低体重儿由于呼吸系统发育不成熟，通气和换气功能障碍，生后给予一定量的氧气吸入才能提高血氧浓度，减少脑缺氧，维持生命，然而国内外学者的研究证明持续大流量的吸氧可以引起视网膜细胞的凋亡加速[2]。雌激素是一类维持机体正常生理状态的重要性激素，包括天然雌激素和人工合成雌激素两大类。天然雌激素为甾体类激素, 包括雌二醇(est radiol, E2)、雌三醇(estriol,E3) 和雌酮(estrone, E1)；人工合成雌激素为非甾体类激素, 但主要结构类似断裂的甾体结构, 仍然有明显雌激素样作用, 主要有乙烯雌酚和氯烯雌酚等。下丘脑分泌促性腺激素释放激素, 调节垂体释放促卵泡生成素和黄体生成, 调节卵巢释放雌激素和孕激素(在男性为睾丸产生的睾酮)； 同时雌激素和孕激素又负反馈作用于下丘脑和垂体, 共同维持人体性激素水平的相对稳定。近年研究发现雌激素受体除了分布于性器官外，在眼组织中也有明显分布，尤其是视网膜和葡萄膜[3，4]。其作用除了一般生理作用外，还通过VEGF调控新生血管生成、通过雌激素受体调控一氧化氮的基础释放以及降低炎症反应程度和缺血再灌注组织的损伤。雌激素在体内通过与雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合而发挥生理功能，ER 有ERα,ERβ两种亚型。ERα主要分布在年轻女性的视网膜神经感觉层和视网膜色素上皮细胞层, 在男性和绝经后女性视网膜神经感觉层和视网膜色素上皮细胞层中分布却很少[2,3]; 而ERβ主要分布在视网膜神经节细胞层和脉络膜。细胞凋亡是生理性或某些因素诱发的程序化的细胞死亡，凋亡过程受基因调控，有着一系列形态和生化改变，特征性的是细胞核DNA被核酸内切酶降解，产生大小为180～200个碱基对整数倍的寡核苷酸片段，可被TUNEL技术特异性标记，表现为细胞核的棕黄色染色。Sennlaub等[5]发现，ROP小鼠视网膜的内核层存在显著的细胞凋亡，Brafman等[6]发现缺氧诱导因子相关的基因缺失能引起视网膜内核层细胞凋亡数目的显著减少，在本研究中通过吸入高氧的方法建立早产儿视网膜病变模型，通过对ROP小鼠视网膜TUNEL染色观察，发现单纯高氧组的RGCL中有一定数目的细胞呈现特征性的凋亡改变，较正常组显著增多，而雌二醇干预组的凋亡细胞数目较单纯给氧组明显减少。RGCL层的细胞主要为视网膜神经节细胞和苗勒氏细胞，视网膜神经节细胞是青光眼、眼外伤等神经退行性病变的主要损伤细胞，它的死亡常导致视功能的不可逆性损害[7]，凋亡的细胞具体是何种细胞尚需要进一步的实验来证明。 视网膜细胞凋亡的机制可能与NO毒性作用有关。NO是一种血管内皮舒张因子，过量的NO可与线粒体释放的超氧化物阴离子反应生成过氧化亚硝基阴离子，并进一步分解成OH，OH等氧自由基产物，氧化蛋白质的巯基，引起DNA的损伤，使线粒体电子传递受阻，导致细胞能量代谢障碍[8]。另外Taylor等[9]和Brune[10]研究发现，NO激活千道尔顿核小体激酶信号通路促进细胞发生凋亡。NOS是NO合成的限速酶，是调节NO的最重要环节。Brooks等[11]研究显示，内皮细胞产生的NO与ROP的眼底病变程度有关，去除NOS的小鼠或NOS被抑制后，小鼠的视网膜血管闭塞及玻璃体新生血管形成减少，ROP严重程度减轻。NOS有3种类型即内皮细胞型(eNOS)、神经元型(nNOS)和细胞因子诱导型(iNOS)，前两者通常在生理情况下起作用，iNOS在某些诱导因素（如缺血缺氧）存在时表达，发挥细胞毒性作用，参与自身免疫病理损害[12]，Sennlaub等[13]发现，缺血性视网膜病变内核层的细胞凋亡同诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的表达密切相关。在本实验中，单纯给氧组iNOS的表达较正常组增高，而雌激素干预组较单纯给氧组iNOS表达减弱，说明雌激素可以通过抑制iNOS的合成，减少NO 的表达，从而减轻NO对视网膜细胞的损伤。而Huang等[14]研究发现，雌激素可通过血管内皮细胞上的雌激素受体(ER)，促进NO 的基础释放。我们认为两者之间的结果差异可能与是否有诱导NOS活化的细胞因子存在和雌激素作用于不同的受体亚型有关,其具体机制有待进一步探讨。
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