【摘要】 探讨膳食牛磺酸防护视网膜光化学损伤的分子机制。方法 30只Sprague-Dawley大鼠饲以AIN-93标准饲料或补充4％牛磺酸膳食干预15 d，给予（3 000±200）lux的持续光照24 h，形态测量法观察视网膜外核层厚度，电生理法检测视网膜功能，Western blot或免疫组织化学法检测活化蛋白-1（actor protein-1，AP-1）亚单位c-fos/c-jun蛋白表达，荧光定量PCR法检测其mRNA表达。结果 光照能降低视网膜外核层厚度，降低视网膜电图a波和b波的幅度，升高AP-1蛋白和mRNA的表达，4%膳食牛磺酸在转录和翻译水平下调AP-1的表达，有效防护视网膜光化学损伤。结论 转录因子AP-1在膳食牛磺酸防护视网膜光损伤中发挥着重要作用。
【关键词】 活化蛋白-1 牛磺酸 视网膜 光损伤
Abstract：Objective To investigate the underlying molecular mechanism involving in dietary taurine protecting retina from photochemical damage.Methods Thirty Sprague-Dawley rats fed with or without 4% taurine under AIN-93 diet for 15 d were persistently exposed to fluorescent light(3000±200 lux) for 0-24h.The thickness of outer nuclear layer(ONL)of retinas was measured with morphometry.The retinal function was detected with electrophysiological technique.The expression of actor protein-1(AP-1)subunits c-fos/c-jun protein was analyzed with Western blot or immunohistochemical method,and their mRNA expression determined with quantitative real-time PCR(qRT-PCR).Results There was a decrease in thickness of ONL, and in amplitude of a- and b- waves of electroretinogram,an increase in protein and mRNA expression of c-fos/c-jun subunits in retinas of rats exposed to light.4% dietary taurine effectively prevented retinal photochemical damage as changes of morphology and electroretinogram(ERG).Also,the supplementation caused a down-regulation in expression of c-fos/c-jun subunits.Conclusions Transcription factor AP-1 plays a pivotal role in dietary taurine protecting retina from photochemical damage.
Key words:actor protein-1;taurine;retina;light damage
视网膜光化学损伤是视网膜光损伤最主要的一种形式，其早期病理表现为视网膜功能减退，视网膜内外节段排列紊乱甚至断裂消失，感光细胞变性丢失，外核层（Outer nuclear layer，ONL）厚度变薄，后期病理表现为视网膜感光细胞凋亡性坏死，视觉功能严重受损甚至失明［1］。针对视网膜光化学损伤的各致伤环节，现已发现钙通道阻滞剂、地塞米松、天然抗氧化剂、自由基清除剂，以及神经营养因子等对光化学损伤有一定的保护作用，然而这种防护作用的效果并不理想［2］。牛磺酸（Taurine）是体内一种游离的条件必需氨基酸，在视网膜尤其是感光细胞和Muller细胞内含量极为丰富，在视网膜生长发育、维持正常视功能等方面发挥着重要的作用。作者以往研究发现牛磺酸作为强抗氧化剂，能降低视网膜光损伤中的丙二醛含量，同时升高超氧化物歧化酶、谷胱苷肽还原酶的活性，阻止视网膜感光细胞的凋亡，但这种抗凋亡效应的分子机制还不清楚［3,4］，有研究显示视网膜光损伤中转录因子AP-1的表达上调［5］。本研究以Sprague-Dawley大鼠光化学损伤为实验模型，观察AP-1亚单位c-fos/c-jun在膳食牛磺酸防护视网膜光损伤中的表达变化，以探讨牛磺酸防护视网膜光化学损伤的具体分子机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
牛磺酸购于北京世纪维他生物技术有限公司；GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒（Cat.GMS30005.2）购自上海杰美基因医药科技有限公司；兔抗大鼠c-fos、c-jun单克隆抗体、SP 试剂盒羊抗兔IgG(SP9001)、DAB试剂盒购于中杉生物制品有限公司；SYD-I型多功能光照控制箱和SYD-Ⅱ型暗适应箱：本研究组与西南师范大学物理学院联合研制；光学显微镜：Olympus BX51型，日本；视觉电生理刺激仪：AVES－8000型，国产；电转移装置：Bio-rad公司，美国；核酸蛋白检测仪：Eppendorf公司，美国凝胶成像系统：DC290，美国。
1.2 动物及分组
30只清洁级Spregue-Dawley大鼠由第三军医大学第三附属医院动物中心提供，体重（150±20）g，雌雄不拘。随机分为以下三组，每组10只：①正常对照组 饲以AIN-93标准饲料；②光照组 饲以AIN-93标准饲料，（3 000±200）lux持续光照24 h；③牛磺酸组 AIN-93标准饲料中添加4％牛磺酸15 d后，（3 000±200）lux持续光照24 h。实验动物经处理后，检测视网膜电图（ERG），乙醚麻醉断头处死，一只眼用于测量外核层厚度，另一只眼用于检测AP-1亚单位c-fos/c-jun蛋白或mRNA表达。
1.3 视网膜形态学观察
参照文献［6］。去除眼球外周结缔组织，在眼球三点钟位置留下少量结缔组织并保留视神经以标记眼球方位。10％的中性甲醛固定，常规石蜡包埋，经视神经矢状纵切眼球，作5 μm厚切片，选取视神经乳头（Optic nerve head，ONH）旁颞侧组织行苏木精－伊红染色后，光镜下观察视网膜各层结构变化，并采用Bio-Rad图像分析系统测定各组视网膜外核层厚度。
1.4 视网膜电图检测
大鼠经暗适应24 h后， AVES-8000型视觉电生理刺激仪记录暗适应视网膜电图（ERG）。甲基纤维素角膜表面麻醉，速眠新注射液腹腔内注射（1.0 ml/Kg体重）麻醉，托吡胩胺散瞳20 min.记录电极为环形金电极，置于大鼠眼角膜缘；参考电极和接地电极为不锈钢针，分别置于记录眼同侧内眦部以及额正中皮下。采用单次闪光刺激，刺激光强为2.00 cd·s·m-2，叠加5次，每次间隔2 min，通频带为1～300 Hz，记录ERG的a波、b波振幅以及潜伏时间。
1.5 免疫组织化学法检测c-fos蛋白表达
按照免疫组化染色试剂盒说明书进行。石蜡切片梯度酒精脱蜡水化，3％H2O2孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原20 min，正常血清封闭液10 min，兔抗大鼠c-fos单克隆抗体以1∶100稀释（阴性对照用PBS代替），37℃ 2 h，PBS漂洗3 min×3，生物素标记二抗工作液，37℃ 10 min，PBS漂洗3 min×3，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃ 10min，PBS漂洗3 min×3，最后3，3’二氨基联苯胺（DAB）显色5～10 min，封片并照相。
1.6 Western blot检测c-jun蛋白表达
按照蛋白质西方杂交印迹试剂盒说明书进行。常规方法提取视网膜总蛋白，经Lowry法定量后，取40 μg总蛋白进行凝胶电泳并转移至聚偏(二)氟乙烯膜上，1%牛血清白蛋白封闭，1∶400 c-jun单抗4℃过夜，1∶40生物素化二抗工作液室温振摇1 h，1∶40稀释辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素三抗工作液室温振摇1 h，DAB显色，Bio-Rad图像分析系统扫描各条带的灰度值。
1.7 荧光定量PCR法检测c-fos/c-jun mRNA表达 采用TRIZol试剂盒提取各组视网膜总RNA，取4μl RNA模板做逆转录成cDNA。Primer Express software 2.0 (PE Biosystems)软件设计c-fos/c-jun寡核苷酸引物和TaqMan探针。内参β-actin：正义链 5'-GCG CGG CTA CAG CTT CA-3'，反义链5'-TCT CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3'，探针序列5'- FAM-CAC CAC GGC CGA GCG GGA-TAMRA -3'；c-fos：正义链5'- GGA GGT CTG CCT GAG GCT TC -3'，反义链5'- CAC GTT GCT GAT GCT CTT GAC -3'，探针序列5'-FAM- CAA CGA CCC TGA GCC CAA GCC AT -TAMRA-3';c-jun：正义链5'- GAC GGA CCG TTC TAT GAC TGC -3'，反义链5'- GGA GGA ACG AGG CGT TGA -3'，探针序列5'-FAM- TGG AAA CGA CCT TCT ACG ACG ATG CC -TAMRA-3'。所有引物由上海生工公司合成。利用ABI Prism 7000 TaqMan 实时荧光热循环仪(PerkinElmer Life Sciences)检测c-fos/c-jun的mRNA表达量。热循环参数：93℃ 2min, 93℃ 1min,55℃ 1min，70℃ 30s，40个循环。c-fos/c-jun mRNA的相对表达量为与β-actin的拷贝数之比。
1.8 统计分析
所有数据用Stat-Light软件（Yukmus Co.,Tokyo, Japan）进行统计学处理，结果用±s表示。三组间视网膜电图和ONL厚度先用单因素方差分析（ANOVA）检验其差异性，然后采用Ryan's 法进行多组间比较。光照组和牛磺酸处理组间c-fos/c-jun mRNA和蛋白的表达量用Student's t检验。所有显著性水平设定为P＜0.05.
2 结果
2.1 外核层厚度（图1）
对照组、光照组和牛磺酸组视网膜外核层的平均厚度分别为（33.5±8.3）,（18.8±6.7）和（29.6±7.4）μm.光照导致视网膜厚度在对照组减少了47.1%，在牛磺酸组减少了16.7%，且视网膜厚度在牛磺酸组与光照组间有显著性差异（P＜0.05），而牛磺酸组与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。
2.2 视网膜功能（表1）
视网膜经光照后，a波和b波的波型不典型，波幅降低，甚至熄灭，潜伏期延长。而牛磺酸干预组具有典型的a波和b波，与光照组相比，a波、b波幅值增加（P=0.016），潜伏期减少（P=0.015）；与对照组相比，除a波幅值降低外（P=0.03），其它指标无显著性差异（P=0.41）。表1 膳食牛磺酸改善光照视网膜功能
2.3 c-fos表达（图2）
免疫组化结果显示，对照组视网膜c-fos抗体染色在内核层（INL）有散在阳性细胞分布，ONL偶见阳性细胞；光照组INL中阳性细胞染色加深，而ONL中阳性细胞在光照早期随光照时间增多，后期未观察到阳性细胞；牛磺酸组光照后INL阳性细胞也增多，而ONL阳性细胞较少（图2A）。qRT-PCR结果显示，c-fos mRNA的表达在对照组较低，在光照1h呈应激性增高（P=0.017），牛磺酸组在光照1h c-fos mRNA表达也显著低于光照组（P＜0.01）（图2B），该结果与免疫组化结果相符，提示牛磺酸能在转录和翻译水平下调c-fos表达。
2.4 c-jun表达（图3）
Western blot结果显示，光照组视网膜c-Jun蛋白表达，与对照组相比，6 h开始增高，9 h达到高峰，其后表达量仍然维持较高水平，牛磺酸组c-Jun蛋白表达在9、12、24 h蛋白表达相对量低于对照组（Ｐ＜0.05）；且在整个光照期间都低于光照组(P＜0.05)（图3A）。视网膜c-jun mRNA表达在光照3 h开始增高，6 h达到高峰，12 h仍然有较高表达，而在牛磺酸组光照6 h后显著低于光照组的相应时相点（Ｐ＜0.05）（图3B）。
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