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　　超声微泡介导EGFP质粒对视网膜母细胞瘤细胞转染效率的实验研究

　　周希瑗，邓鑫，王志刚

　　重庆医科大学附属第二医院眼科 400010

　　视网膜母细胞瘤是最常见的儿童眼内恶性肿瘤。目前的治疗方式有直接摘除眼球及剜出眼眶内容物、化学减容法、激光光凝、温热疗法、冷冻疗法、外照放疗等。基因治疗尚处于研究阶段。微泡造影剂作为一种新型的基因转移载体，可携带基因在声像图的监控下进行超声辐照，微泡能够在指定部位“爆破”，释放所携带的基因。本文通过体外实验研究超声微泡造影剂携带EGFP基因对视网膜母细胞瘤细胞进行转染的效率及探讨最适转染条件。

　　首先检测微泡造影剂和超声对体外培养的RB细胞生长活性的影响。将培养的RB细胞分为9组，分别予以0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 W/ cm2声强,作用时间均为60 s的超声波照射，和1%, 10%, 20%,30%浓度梯度的微泡造影剂。台盼蓝染色计数死细胞和活细胞。结果显示：当超声强度为0.25、0.5及0.75  W/cm2，时间60 s时，细胞存活率均＞95％；当超声强度为1.0 及1.25 W/cm2，时间60 s时，细胞存活率＜80％。微泡浓度为1%、10%、20%时，细胞存活率均＞90％；微泡浓度为30%时，细胞存活率＜80％。在0.25～0.75 W/cm2 、60 s范围内的超声，和低于20%的微泡浓度，对RB细胞的生存无影响。

　　然后在此基础上，以几种不同参数的超声对RB细胞进行EGFP基因转染，分为4组：微泡浓度固定为10%，超声声强分别为0.25，0.5，0.75 W/cm2，60 s，连续波发射进行转染（共3组）；并增加一组对照组（微泡浓度固定为10%，超声声强1.0 W/cm2 ，60 s，连续波发射）。24～48 h后，荧光显微镜观察EGFP蛋白表达， RT-PCR检测mRNA表达。结果显示：0.5 W/cm2及0.75 W/cm2 声强处理的RB细胞可见较多绿色荧光及较亮电泳条带，且二者表达情况相似。而声强0.25 W/cm2及1.0 W/cm2 处理组中RB细胞的转染效率均不如上述两种声强条件。

　　本实验以超声微泡造影剂为基因载体对体外培养的RB细胞进行转染，探讨其对RB细胞生长活性的影响、合适的转染条件。然而RB的基因治疗尚处于起步阶段，真正应用于临床需进一步的研究。

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