角膜结膜及泪器病             808                                      PO0224

　　棘阿米巴滋养体与角膜细胞共培养研究

　　高敏 罗时运 李然 王智群 安莹 张岩 陈威 孙旭光

　　首都医科大学附属北京同仁医院 北京同仁眼科中心 北京市眼科研究所 100005

　　目的：观察棘阿米巴滋养体﹑包囊及棘阿米巴对数生长期培养上清液与人角膜上皮细胞、角膜基质细胞的共培养过程。分析棘阿米巴培养液与对数生长期培养上清液蛋白谱差异。

　　方法：建立体外培养人角膜上皮细胞、人角膜基质细胞系，以呈浓度梯度的棘阿米巴滋养体与角膜细胞作用，不同时间点观察玻片面上残存的细胞百分比，比较两种细胞系对棘阿米巴滋养体敏感性的差异。以棘阿米巴滋养体致角膜细胞损伤的最适浓度分别与人角膜上皮细胞、角膜基质细胞作用，不同时间点取片，分别进行姬姆萨染色光镜下观察和戊二醛固定后扫描电镜观察。同上方法，观察棘阿米巴对数生长期培养上清液与角膜细胞共培养过程的变化。棘阿米巴包囊与角膜细胞共培养，观察共培养过程中的变化，并定量计数棘阿米巴包囊、滋养体及滋养体所占百分比随时间点变化。新鲜配置棘阿米巴培养液，离心收集棘阿米巴对数生长期培养上清液，两样本均进行SDS-PAGE电泳，电泳胶带分别采用考马斯亮蓝和硝酸银染色观察分析。

　　结果：两种角膜细胞系对棘阿米巴滋养体敏感性有所不同。较低浓度（104/ml）的棘阿米巴滋养体即可引起角膜基质细胞的损伤，而要引起角膜上皮细胞的损伤，则需要更高的滋养体浓度（105/ml）。在106/ml的棘阿米巴滋养体作用下，两种细胞系均可产生明显的损伤。棘阿米巴对数生长期培养上清液同样可引起角膜细胞的损伤。106/ml的棘阿米巴包囊与角膜细胞共培养，2.5~3小时后，棘阿米巴包囊（近100%）开始向滋养体形态转化，并逐渐增多，24小时后几乎全为滋养体状态。SDS-PAGE电泳结果显示：棘阿米巴培养液与对数生长期棘阿米巴培养上清液电泳条带在考马斯亮蓝染色条件下，仅见一条共同的位于66.2kDa左右的条带；而在硝酸银染色条件下，两条带则呈现明显的差异。

　　结论；棘阿米巴与角膜细胞作用时，接触性细胞损伤与非接触性细胞损伤同时存在，共同起作用。人角膜上皮细胞间具有紧密而有序的缝隙连接，因而与角膜基质细胞相比，具有更强的抵抗棘阿米巴损伤的能力。棘阿米巴包囊作为棘阿米巴原虫的静止期状态，与角膜细胞共培养时，可迅速地向活跃的滋养体转化。

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