角膜结膜及泪器病             1384                                      PO0257

　　真菌性角膜炎分离菌株的改良玻片培养法菌种鉴定及Etest法药物敏感性测定

　　金玉奇 姚玉峰 裘文亚

　　浙江大学医学院附属邵逸夫医院眼科 310016

　　目的： 建立改良玻片培养法对真菌性角膜炎的临床分离菌株进行菌种鉴定并对菌种分布进行分析，用Etest法检测临床分离菌株的药物敏感性。

　　资料与方法：对2002年9月至2006年3月期间就诊于浙江大学医学院附属邵逸夫医院、临床诊断为真菌性角膜炎的216例患者进行病原学检查。临床诊断主要依据病史及角膜化脓性浸润病灶的特征表现。培养标本取自212例临床诊断为真菌性角膜炎并且未发生角膜穿孔病例的角膜刮取物；另外4例患者初诊时角膜己穿孔，因此初诊时未进行病原培养，但对进行治疗性角膜移植术后取下的受体角膜材料进行进一步的病原培养。标本直接接种到血、巧克力、Sabouraud右旋糖（Sabouraud dextrose agar，SDA）和伊红美兰四个琼脂培养基上，置适宜温度下培养。培养阳性的判断标准为：2个或2个以上的培养皿在原接种区域生长同一色泽及形态的菌落。观察并拍照记录各培养菌落的形态、色泽及生长情况。再采用我们建立的一种改良玻片培养法对分离菌株进行菌种鉴定，方法如下：将在SDA培养基上生长良好菌落的1/4转接种至另一SDA培养基上，以接种点为直角顶点放置20×20mm的消毒盖玻片，室温下培养2～4天，当菌丝沿着盖玻片的两边向玻片内生长到一定程度时，将玻片小心取出翻转后贴在滴有乳酸酚棉蓝染液的载玻片上，用25×50mm盖玻片压片，在显微镜下观察并拍照记录菌丝、孢子的形态以及它们之间的关系，最后综合菌落形态、色泽及生长速度鉴定菌属和菌种。若培养分离到的为酵母菌，需根据生物梅里埃鉴定卡对菌种进行进一步鉴定。采用Etest法分别测定分离菌种对氟康唑、伊曲康唑及两性霉素B的药物敏感性。方法如下：制备孢子浓度为0.5-5×106CFU/ml的真菌混悬液，用消毒细菌涂布器将真菌混悬液均匀涂敷在RPMI 1640琼脂培养基的表面，加盖干燥15分钟后，将氟康唑、伊曲康唑、二性霉素B三种药物的Etest测试条（AB BIODISK, Solna, Sweden）贴到培养皿中。将培养皿置35℃、 5% CO2 培养箱中培养24小时，根据抑菌环与测试条相交点的刻度读出最低抑菌浓度（Minimal Inhibit Concentration；MIC）值。药物敏感的判断标准：氟康唑MIC值≤64ug/ml、伊曲康唑MIC值≤1.0ug/ml、二性霉素B MIC值≤1.0 ug/ml，判断相应菌株对相应药物敏感。

　　结果： 临床诊断为真菌性角膜炎的216只眼中，真菌病原培养阳性者为164例165株，阳性率76.4%。共分离到16个菌属38个菌种。菌种分布为：丝状菌160株（97.0%）, 酵母菌3株（1.8%）, 双相菌2株（1.2%）。丝状菌的菌种分布：镰刀菌（n=77, 46.7%），曲霉菌(n=23, 13.9%)，暗色菌（n＝21，12.7%），顶孢霉菌（n=12，7.3%），以及其他少见菌种共27株（16.4%）。21株暗色菌的具体菌种分布：弯孢霉(n=8，4.8%)、 链隔孢(n=8，4.8%)、单隔孢（n＝2，1.2%）、平脐蠕孢霉(n=2，1.2%)、突脐蠕孢霉(n=1，0.6%)。少见丝状菌种包括金孢霉(n=5，3.0%)、毛癣菌(n=3，1.8%)、炭疽菌（n＝3，1.8%）、轮枝孢菌(n=1，0.6%) 、足分支菌(n=1，0.6%)。另外，有14株（8.5%）的丝状菌采用目前的鉴定方法无法辨析具体菌种。分离到的酵母菌均为念珠菌(n=3，1.8%)。分离到双相菌分别为芽生菌(n=1，0.6%)和孢子丝菌(n=1，0.6%)。另外，从一个患者的角膜标本上同时分离到2个菌种，分别为突脐蠕孢霉菌和近平滑念珠菌。

　　药物敏感试验的检测结果如下：77株镰刀菌对二性霉素B敏感的有37株(48.1%)，对伊曲康唑敏感的有1株(1.3%)，对氟康唑敏感的有2株(2.6%)。23株曲霉菌对伊曲康唑均敏感，对二性霉素B敏感的有9株(39.1%)，对氟康唑敏感的有2株(8.7%)。21株暗色菌对二性霉素B均敏感，对伊曲康唑敏感的有18株(85.7%)，对氟康唑敏感的有19株(90.5%)。12株顶孢霉菌对伊曲康唑敏感的有9株(75%)，对二性霉素B敏感的有3株(25%)，对氟康唑敏感的有9株(75%)。32株其他其他丝状菌、双相菌和酵母菌的药物敏感试验结果依菌种的不同差异较大，对二性霉素B、伊曲康唑及氟康唑敏感的分别有25（78.1%）、19（59.4%）、12株（37.5%）。

　　结论：本研究建立了一种新的鉴定真菌的改良玻片培养法，这种方法快速、简便、准确，在保持真菌自然生长状态的同时可以染色观察，是一种值得进一步推广的新方法。菌种分布分析发现，有16属38种的真菌导致了真菌性角膜炎，其中以镰刀菌最常见，曲霉菌次之，暗色菌和顶孢霉菌也是导致真菌性角膜炎的较常见病原菌。Etest法的抗真菌药物敏感试验可以便捷、准确地检测分离菌株对不同抗真菌药物的敏感性，并可能为临床选择药物提供重要的参考依据。

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