角膜结膜及泪器病             2089                                      PO0309

　　人角膜内皮细胞分离方法的实验研究

　　邵应峰 陈家祺 胡诞宁

　　广州中山眼科中心 510060

　　【目的】对照研究三种不同的人角膜内皮细胞分离方法的效果，探讨快速、高效的人角膜内皮细胞分离采集方法。

　　【方法】保存于Optisol中的角膜移植术后的残余的供体周边角膜（rim）12份，供体年龄均<20岁，供体死亡至细胞分离采集时间间隔<72小时，全部样本始终保存于4℃。将rim均分为三，将后弹力膜机械性剥离，分别使用三种方法分离角膜内皮细胞：A组，贴皿培养法（DP）；B组，0.02%EDTA浸泡法（EDTD）；C组，0.4%collagenase消化法（CA）。然后用含15％胎牛血清、10ng/ml EGF、10ngml bFGF和二抗的DMEM/F12(1:1)混合培养液，于37℃，含5％CO2的潮湿培养箱内进行培养。1周后进行细胞传代和计数。结果进行配对资料的t检验。

　　【结果】A组：细胞部分爬出后弹力膜，在后弹力膜周围聚集生长，但后弹力膜表面仍有大量内皮细胞无法培养利用。B组：内皮细胞散在生长，后弹力膜表面仍有内皮细胞。C组：内皮细胞大多呈多处聚集生长，可见少量后弹力膜细小碎片。三组平均细胞计数分别为：4.6×104±0.6个，5.0×104个，6.1×104个，三组比较p值均小于0.01。

　　【结论】三种人角膜内皮的分离方法均安全有效，其中贴皿法细胞爬出速度缓慢，且不充分。EDTA浸泡法可使大量内皮细胞从后弹力膜脱落，直接在培养皿底部生长，但后弹力膜表面仍有较多内皮细胞残留，无法培养利用。胶原酶消化法，可将后弹力膜全部或大部分消化，并且不对内皮细胞造成损伤，分离内皮细胞效果最为充分彻底。

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