【摘要】 目的：研究缺氧条件下体外培养人视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium, RPE) 细胞中信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）的活性状态 。
方法：将培养的人RPE细胞置于含10mL/L O2，50mL/L CO2和940mL/L N2的培养箱内建立缺氧模型。于缺氧后1，3，6，12和24h，用激光共聚焦显微镜观察STAT3蛋白在RPE细胞内的定位，Western blot检测STAT3蛋白的磷酸化水平。
结果：常氧状态下，STAT3蛋白荧光主要分布于RPE细胞胞质内。缺氧后，细胞质内绿色荧光强度减弱，细胞核荧光强度明显增强。随缺氧时间的延长，STAT3蛋白的磷酸化水平逐渐增高，至12h表达最强，24h开始下降。
结论：缺氧后体外培养人RPE细胞内STAT3蛋白磷酸化水平增高，STAT3蛋白活化，由胞质向胞核内转位。
关键词：缺氧；STAT3；视网膜色素上皮细胞
【关键词】 缺氧 STAT3 视网膜色素上皮细胞
0引言
脉络膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）可见于多种眼部疾病，常因累及黄斑而导致中心视力下降，严重时可致失明。CNV的病因尚未阐明，缺血缺氧可能是其发生的重要始动因素之一［1］。在CNV的形成过程中，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞具有关键性的调控作用，缺氧可诱导RPE细胞释放多种细胞因子，继而参与基底膜的降解，并作用于脉络膜毛细血管内皮细胞，调节血管内皮细胞的增生和移行，以及新基底膜的沉积等，最终形成新生血管［2］。STAT3是信号转导与转录激活因子家族（signal transducer and activator of transcription, STATs）的重要成员，广泛表达于多种组织和细胞中，在细胞的增生、分化、凋亡以及血管新生等方面发挥重要的调控作用［3］。新近研究提示，STAT3也可能参与了CNV的发生过程［4］。但是在缺氧诱导的CNV发生中STAT3是否也发挥同样的作用目前尚不明确。我们观察缺氧对体外培养的人RPE细胞内STAT3蛋白活性的影响，探讨STAT3在缺氧诱发CNV发生机制中可能发挥的作用。
1 材料和方法
1.1材料 人RPE细胞由本研究所朱洁博士馈赠，培养方法同前［5］，用含10mL/L灭活新生牛血清（Gibco）、100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco) 培养RPE细胞，置于37℃，50mL/L CO2的孵箱中，3～4d换液1次，待细胞生长至80％铺满后，以2.5g/L胰蛋白酶消化传代，选取第4～7代细胞用于实验。
1.2方法 将5×104个细胞接种于直径3cm的培养皿，待细胞生长至约70%～80％铺满时将细胞置于37℃，10mL/L O2，50mL/L CO2，940mL/L N2的缺氧细胞培养箱内继续培养0，1，3，6，12和24h，收集细胞用于后续实验。将RPE细胞接种于预先放置盖玻片的培养皿中培养24h。缺氧处理后弃去培养液，用预冷的PBS漂洗3次，40g/L多聚甲醛4℃固定30min，PBS漂洗3次，1mL/L Triton X100进行透化处理4℃ 20min，50mL/L羊血清37℃封闭1h，滴加小鼠抗人STAT3抗体(1:100, 美国Santa Cruz公司)并置于湿盒内4℃过夜。PBS漂洗3次，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG（1∶100, 北京中杉金桥公司），于37℃湿盒避光孵育1h，PBS漂洗3次，用激光共聚焦显微镜进行观察。另收集RPE细胞，预冷PBS漂洗2次，裂解细胞提取总蛋白。80g/L SDSPAGE分离蛋白，采用湿转法将蛋白电转移至PVDF膜，50g/L脱脂奶粉室温封闭1h，分别用小鼠抗人pSTAT3(Tyr705)和小鼠抗人STAT3抗体(1∶150，美国Santa Cruz公司)4℃孵育过夜，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体(1∶1 000，美国Sigma公司)室温孵育1h，增强型发光底物检测二抗，暗室曝光显影。为检测目的蛋白的磷酸化水平，参照文献［6,7］，实验重复3次，以STAT3总蛋白为内参照，计算不同时间点STAT3磷酸化蛋白的条带占同一时间点STAT3总蛋白的条带的积分光密度比率，该值即反映磷酸化蛋白的相对表达量。
统计学处理：利用SPSS13.0统计分析软件，采用配对t检验进行统计学分析。
2结果
2.1 STAT3蛋白的定位 激光共聚焦显微镜观察，STAT3蛋白呈绿色荧光。常氧状态下，STAT3蛋白主要分布于RPE细胞胞质内，细胞核内未见明显荧光。缺氧1h细胞核可见微弱荧光。随缺氧时间的延长，细胞质内绿色荧光强度逐渐减弱，细胞核荧光强度逐渐增强，至缺氧后12h，细胞核荧光强度达到最高水平，24h后开始减弱。提示缺氧可促使RPE细胞胞质内STAT3蛋白移入胞核内（图1）。
2.2磷酸化STAT3蛋白的表达 常氧条件下，RPE细胞内磷酸化STAT3蛋白表达量微弱。随缺氧时间延长，磷酸化STAT3蛋白表达逐渐增强，至12h达到峰值，24h开始下降，但仍高于常氧状态（图2）。
图1 STAT3蛋白的表达 (IF×600)（略）
A：常氧；B：缺氧12h
图2 缺氧对体外培养人RPE细胞磷酸化STAT3蛋白表达的影响。（略）
1：常氧组；2：缺氧1h；3：缺氧3h；4：缺氧6h；5：缺氧12h；6：缺氧24h
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