作者：王峰，常 青，杜新华

　　【摘要】  了解角膜碱烧伤急性期治疗中新鲜羊膜移植促进角膜上皮愈合和抑制基质浸润及瘢痕形成的作用。方法：从15只正常新西兰大白兔中随机选取3只兔做正常对照，其余12只兔制作双眼角膜碱烧伤模型，右眼行羊膜移植，左眼为对照。分别于术后14，30d取材角膜进行PMN（多形核白细胞）计数，光镜及透射电镜观察。结果：在炎性细胞浸润，角膜上皮细胞数量、形态、排列及成纤维细胞数量和细胞内结构方面，新鲜羊膜移植组均优于碱烧伤组。结论：新鲜羊膜移植在角膜碱烧伤急性期治疗中具有较强的促进上皮愈合和抑制炎症及瘢痕形成的作用。

　　【关键词】  羊膜移植

　　0引言

　　眼部碱烧伤是常见的眼外伤之一，传统的治疗方法效果不佳，目前羊膜移植治疗眼表面疾病成为一个新的方向。本实验以兔双眼角膜碱烧伤为实验模型，右眼实施早期新鲜羊膜移植术治疗，同期对比观察双眼的角膜组织结构改变。

　　1材料和方法

　　1.1材料  健康新西兰大白兔15只，体质量2.0～2.5kg，雌雄不限，眼表未见异常。随机选取3只共6眼作正常对照，余12只兔制作双眼碱烧伤模型，随机分为两组（14d组和30d组），24h后右眼行新鲜羊膜移植，左眼为对照。

　　1.2方法  新鲜羊膜取自健康剖宫产产妇的胎盘组织，产前血清学检查排除乙肝、丙肝、梅毒及获得性免疫缺陷综合征，取材均在无菌操作下完成。产后立即将胎盘羊膜面用无菌生理盐水冲洗干净, 自羊膜与绒毛膜之间的潜在空隙钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离，后置于4MU/L庆大霉素生理盐水中，放入4℃冰箱中备用。所制羊膜均于取材后12h内使用。倍诺喜眼表面麻醉，置开睑器，充分暴露眼前段表面，棉签拭去眼表过多水分，以浸有1mol/L NaOH溶液直径为6mm的单层圆滤纸片置于兔双眼角膜表面，60s后取下，建立角膜重度碱烧伤模型，立即用生理盐水冲洗眼表面及结膜囊。24h后右眼行羊膜移植，左眼为对照。氯胺酮50mg/kg和异丙嗪25mg/kg 1∶1比例混合背部皮下注射4mL进行全身麻醉。沿角膜缘360?觷环形剪开结膜，将备好的羊膜片上皮面朝上平铺于眼表面，其边缘超出角膜缘2mm，用10-0无损伤缝线间断缝合，固定于浅层巩膜使羊膜紧贴于角膜创面，然后将球结膜缝回至角膜缘，减去周边多余羊膜，术毕结膜囊内涂红霉素眼膏。2.5g/L氯霉素眼药水点眼，4次/d，于睑缘缝合2针闭合眼睑。正常对照组兔于实验开始时即通过气体栓塞法处死。实验兔分别于羊膜移植术后14，30d采取同法处死，取材角膜组织，分别固定于甲醛或戊二醛固定液中，经相应处理后在普通光学显微镜下或H-600透射电镜下观察并照相。

　　2结果

　　2.1实验观察  角膜碱烧伤后立即出现灰白色境界清楚的圆形灼伤区，局部水肿混浊，次日扩展到整个角膜。碱烧伤组炎症反应较重,分泌物多,角膜表面粗糙不光滑,有较多坏死组织。角膜缘重度睫状充血，3～5d后角膜缘即出现新生血管,其后生长迅速，11d新生血管生长旺盛,其顶端分叉,部分交织呈网状，14d新生血管密集侵入角膜缘内约2.65±0.49mm，30d已达角膜中央，约5.33±0.49mm，角膜呈灰白色血管膜样改变。角膜上皮愈合缓慢,荧光素染色面积大。新鲜羊膜移植组粘性分泌物较少,睫状充血较轻,手术后5d，始出现新生血管芽，个别眼仅见血管轻度扩张，其后缓慢生长，7d可见新生血管管径细，血管透明，14d新生血管侵入角膜缘约2.43±0.74mm，30d新生血管侵入角膜缘内约4.72±0.42mm。角膜上皮愈合较快，荧光素染色面积较碱烧伤组小。

　　2.2光镜观察  正常对照组：角膜上皮4～5层，排列规则，基质层胶原纤维排列整齐，无新生血管浸润。术后14d：碱烧伤组眼表面及角膜基质中有大量的PMN浸润，可见单层角膜上皮细胞覆盖创面，但其排列疏松、紊乱，且形状不规则，前弹力层不清；基质层胶原纤维排列紊乱，粗细不均，纤维间出现明显间隙，可见大量成熟新生血管,管腔扩大，管壁由单层平滑肌构成，管腔内有成熟红细胞。新鲜羊膜移植组：角膜表面及基质层内少量PMN浸润，上皮细胞增至2～3层；胶原排列相对整齐,已形成双层的角膜上皮，其排列较规则，角膜浅基质层内可见新生毛细血管，由单层内皮细胞围绕，管腔内无红细胞，且管径较小，分布较稀疏。术后30d：碱烧伤组仍可见较多的PMN浸润，上皮细胞虽已增至4～5层，但排列仍不规则，基质层胶原纤维增生明显，形成瘢痕；新鲜羊膜移植组角膜内炎性细胞浸润少，上皮排列较规则，胶原纤维排列整齐。

　　2.3 PMN计数  在Q550CW全自动图像分析仪上进行。在20倍物镜下进行PMN计数,每张切片从周边到中央随机取浅基质层的5个视野（10 000μm2），并取其均值进行统计分析（配对t检验）。结果显示：14d，羊膜移植组较碱烧伤组有显著性差异（P ＝0.022）；30d，羊膜移植组较碱烧伤组有非常显著差异（P ＝0.001，表1）。

　　2.4透射电镜结果

　　2.4.1正常对照组  角膜上皮细胞4或5层，细胞核无崩解变形，细胞间连接紧密。基质层大多为成熟的纤维细胞，呈梭形，胶原纤维粗细均匀，呈板层排列整齐，层内平行排列，层间相互垂直。

　　2.4.2羊膜移植术后14d  ①碱烧伤组可见单层角膜上皮细胞覆盖创面，细胞水肿，排列不整齐，细胞间隙增大，细胞核肿胀，前弹力膜消失，半桥粒数量较少；角膜基质层胶原纤维排列紊乱且出现断裂现象，基质中成纤维细胞丰富，细胞核较正常组大，常染色质丰富，少量异染色质沿核膜分布，粗面内质网扩张，高尔基复合体丰富，线粒体肿胀。②羊膜移植组可见2～3层上皮细胞，细胞连接较疏松，但优于碱烧伤组。成纤维细胞数量少于烧伤组，但较正常角膜多，羊膜移植组中胶原纤维断裂的情况和成纤维细胞从静止型向分泌型转化的情况明显较对照组少。

　　2.4.3羊膜移植术后30d  ①碱烧伤组可见角膜上皮细胞已有3或4层，细胞水肿较14d组明显减轻，但细胞形态仍不规则且排列疏松。基底膜形成，但有不连续现象，角膜基质层胶原纤维增生明显。②羊膜移植组角膜上皮细胞形态较规则，接近正常角膜上皮细胞，且细胞排列密集。上皮细胞间可见桥粒连接，上皮基底细胞于基底膜之间可见半桥粒。基质层胶原纤维排列较整齐，成纤维细胞数量较14d明显减少，成纤维细胞相对成熟，静止的纤维细胞相对较多。

　　3讨论

　　近年来，临床观察发现，羊膜移植用于碱烧伤的眼表面后，减轻了局部炎症反应，促进了角膜上皮的再生，阻止了角膜血管化，瘢痕化，为临床治疗提供了一条有效途径[1-4]。本文旨在将兔角膜碱烧伤后行羊膜移植，观察其疗效，并从形态学找寻依据。

　　本试验的结果显示：羊膜移植组较碱烧伤组炎症反应轻,分泌物少，新生血管生长慢并且密度也较小，角膜荧光素染色显示羊膜能明显促进角膜上皮细胞的生长。PMN计数经统计学处理得出，同期羊膜移植组较碱烧伤组炎性细胞少，并具有显著性差异。这是因为羊膜具有延长上皮生发细胞的寿命及维持其克隆增殖能力，增强基底上皮细胞的粘附，以及促进上皮细胞分化和阻止上皮细胞调亡的作用[5]。其上皮细胞分泌的HGF、bFGF、EGF、KGF等生长因子以及KGFR、HGFR等受体[6]，也促进了上皮的修复。同时，羊膜基底面与去除表层坏死角膜组织后较健康基质较为紧密的接触、封闭，能够显著减少通过泪膜侵入基质的大量多形核白细胞；羊膜基质能促使白细胞凋亡而消除炎症；其上皮细胞分泌的细胞因子能抑制PMN活化，减少炎性介质的产生及抑制其活化[7]。

　　透射电镜的结果表明，正常对照组角膜上皮细胞形态规则，连接紧密。碱烧伤组角膜上皮细胞水肿，排列不整齐，细胞间隙增大，上皮细胞与前弹力膜的联接疏松，半桥粒数量较少，与严军等[8]的结果一致。该组胞质内细胞器变化表现为，基质中纤维细胞被激活为成纤维细胞，胞质内出现丰富的粗面内质网，有的区域还可看到高尔基复合体，这是因为新的蛋白质的合成和分泌离不开上述细胞器；同样时相段内细胞核中，常染色质丰富，这是细胞代谢功能代偿性增强的结果，异染色质可能部分转化为常染色质并螺旋化，以加快核内物质的转录效率，但损伤后细胞中的线粒体却不发达，并且出现肿胀现象，这可能是碱性物质对线粒体等细胞器的作用进行了破坏和抑制[9]。以上现象充分表明，碱烧伤后激活了静止的纤维细胞，使其成为成纤维细胞，从而大量分泌胶原纤维，促进创伤的修复。纤维组织增生虽然是眼表伤口愈合的必经过程，但过多的胶原分泌必将在眼表形成瘢痕，破坏角膜的透明度，对视功能产生严重影响。而同期的羊膜移植组的成纤维细胞数目低于碱烧伤组。这可能是因为羊膜移植于眼表后，首先起到了一个机械性的保护作用，防止基质层胶原组织暴露溶解；上皮细胞的修复，也使成纤维细胞处于细胞周期的G1期，抑制了其在角膜受损后的活跃功能，从而抑制了胶原的分泌及瘢痕的形成。另有研究证实，TGF-β1是一种在伤口愈合过程中调整成纤维细胞活性的纤维生长原型细胞因子，而羊膜具有抑制TGF-β1ｍRNA表达的作用[10]。

　　本次实验通过兔眼碱烧伤模型的建立，证实了新鲜羊膜移植对碱烧伤急性期有较好的治疗作用，为我们的临床工作提供了坚实的实验依据。

　　【参考文献】

　　1王峰,孙乃学,熊全臣,郭绒霞,杨建刚.新鲜羊膜移植治疗早期重症眼部烧伤.眼科新进展,2003;23(4):278-279

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　　3刘肖艺,刘庆淮.兔角膜缘上皮细胞培养自体移植修复.国际眼科杂志,2005;5(1):83-85

　　4郑晓汾,冯克孝,李冰,杨纪忠,葛京京.兔角膜碱烧伤后不同时期的组织病理学变化.国际眼科杂志,2005;5(3):449-450

　　5 Park WC, Tseng SCG. Temperature cooling reduces keratocyte death in excimer laser ablated corneal and skin wounds. Invest ophthalmol Vis Sci ,1998;39(1):449

　　6 Koizumi NJ, Inatomi TJ, Sotozono CJ. Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. Curr Eye Res ,2000;20(3):173-177

　　7陈剑,丁琦,徐锦堂,吴静.新鲜羊膜移植对角膜急性炎症抑制作用的实验研究.眼科,2001;10(4):236-239

　　8严军,肖桃元,杨恬,黄文琪,可金星.兔角膜缘碱烧伤后修复的透射电镜观察.电子显微学报,2002;21(5):547-548

　　9凌诒萍,主编.细胞生物学.北京:人民卫生出版社,2001:87-169

　　10叶纹,沈玺,钟一声.兔角膜重度碱烧伤后羊膜移植的疗效观察.眼科新进展,2002;22(2):81-84