作者：轩旭霞   

    作者单位：430019 湖北武汉，武汉艾格眼科医院

    【摘要】  目的 探讨AE-941(CARTCELL卡特消)对视网膜新生血管形成的抑制作用。方法 将鼠龄为7天的Wistar幼鼠置于75％浓度的氧环境中连续生活5天，建立高氧诱导的血管增生性视网膜病变幼鼠模型。随机分为正常对照、给氧对照组及治疗组（幼鼠玻璃体腔内注射AE-941 0.25 mg，0.5 μl，1 mg/ml，对侧眼注射相同体积的生理盐水作为对照）。采用ADP酶组织化学法行视网膜铺片，了解视网膜血管改变；用组织切片观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目，观察卡特消对视网膜新生血管形成的抑制情况。结果 给氧对照组（鼠龄17天）可见视网膜血管分布紊乱、密度增高，大量的视网膜新生血管，组织切片上可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核。治疗组视网膜血管分布规则、密度减少，突破内界膜的内皮细胞细胞核数目明显减少，两组差异有显著统计学意义(P<0.001)。结论 AE-941可以抑制视网膜新生血管形成，有望成为防治血管增生性视网膜病变的一种有效的方法。

    【关键词】  视网膜新生血管；卡特消

    The inhibitory effects of AE-941 on retinal neovascularization

    XUAN Xu-xia.Wuhan Aige Ophthalmic Hospital，Wuhan 430019，China

    ［Abstract］  Objective  To explore the inhibitory effects of AE-941 on retinal neovascularization.Methods  One-week-old Wistar mice were put into the environment with 75% oxygen for 5 days to establish models of vascular proliferation retinopathy.These mice were divided into normal control，high oxygen control and treatment groups(One eye of each mouse received an intravitreal injection of 0.25 mg，0.5 μl，1 mg/ml of AE-941，and the same volume of 0.9％ NaCl was injected into the other eye of the mouse both in these two groups as a control).The ADPase histochemical straining was used for retinal flatmount to observe changes of retinal vessels.The inhibitory effects of AE-941 on retinal neovascularization were evaluated by counting the endotheliocyte nuclei of new vessels extending from retina to vitreous in the tissue-slice.Results  Disorganized distribution and high density of retinal vessels and retinal neovascularization of 17-day old mice in the high oxygen control;regular distributions and reduced density of retinal blood vessels in eyes in the treatment group were found in retinal flatmount.The number of the endotheliocyte nuclei of new vessels extending from retina to vitreous was less in the eyes in the treatment group than which in control group (P＜0.001).Conclusion  Retinal neovascularization can be inhibited  by intravit real injection of AE-941 which suggest that intravitreal injection of AE-941 may have potential theraputic benifits in retinal vascular disease.

    ［Key words］  retinal neovascularization;AE-941

    视网膜新生血管性疾病是致盲的主要原因之一，既往多认为缺血缺氧的视网膜可产生某些因子刺激新生血管生成，并已发现了主要的刺激因子是血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），最终导致大量新生血管生成。AE-941能防止ＶＥＧＦ和其在血管内皮细胞上的受体结合［1～4］，也会防止ＶＥＧＦ和其在内的主动脉内皮细胞上的受体结合，防止ＶＥＧＦ及其受体结合。本研究通过建立高氧诱导的视网膜新生血管动物模型，玻璃体腔注射AE-941，拟观察其对视网膜新生血管形成的抑制作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  鼠龄为7天的健康Wistar幼鼠60只(120眼)，性别不限，幼鼠未断奶，与哺乳母鼠共同饲养，系清洁级动物，由同济医科大学实验动物中心提供。

    1.1.2  实验用药及主要试剂  (1)AE-941;(2)ADP(北京鼎国生物有限责任公司);(3)兔抗CD 31抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒及PBS缓冲液购自博士德公司。

    1.2  方法

    1.2.1  分组  将鼠龄为7天健康的Wistar幼鼠60只，随机分成3组：空白组(n=20)，对照组(n=20)，治疗组(n=20)。

    1.2.2  动物模型的制作  正常对照组新生鼠与哺乳母鼠一起在正常空气环境中饲养。给氧对照组和治疗组新生鼠与哺乳母鼠一起置于密闭容器内，氧气的流量控制在1.5 L/min，使容器内氧气浓度为(75±2)％，期间用测氧仪间断监测容器内的氧浓度，每日4～6次，每天打开1次氧箱更换垫料、加食、换水、替换母鼠。在此高氧环境中饲养5天后回到正常空气环境中饲养。

    1.2.3  给药方法  取幼鼠均麻醉后进行玻璃体腔注射，于生后第7天注射AE-941 (0.25 mg，0.5 μl，1 mg/ml，经预实验筛选的最佳药物浓度)，对照组注射相同体积的生理盐水作为对照。

    视网膜铺片［5］(adenosine 5′-diphosphate ADP酶组织化学法)：三组各取新生鼠10只，鼠龄分别为第12、17天，各5只，进行视网膜铺片，以观察视网膜血管发育及增生情况。具体方法为：（1）麻醉：用(6％水合氯醛)腹膜下注射。（2）灌注：打开新生鼠胸腔，暴露心脏，用灌注针头刺入左心室，立即剪开右心房，先用37 ℃生理盐水灌注约2～3 min，然后灌注4％多聚甲醛溶液约5 min。（3）固定：摘除新生鼠眼球，固定于4％多聚甲醛溶液中。（4）取材：在眼球角膜缘后约1 mm，沿角膜缘环形剪开，去除角膜，取出晶状体，以视乳头为中心，作4～5个放射状切开，去除巩膜、脉络膜，用毛笔扫除玻璃体以及视网膜外层的色素上皮。（5）漂洗：用浓度为0.05 mol/L、pH为7.2的tris-马来酸缓冲液冲洗5次，每次15 min。（6）孵育：于新鲜配制的37 ℃反应液(0.2 mol/L tris-马来酸缓冲液中加入硝酸铅3 mmol/L、氯化镁6 mmol/L、ADP 1 mg/ml)中孵育15 min。（7）显色：用10％(1∶10)硫化铵反应5 min。50%的缓冲甘油封片，光学显微镜下观察结果并照相。

    1.2.4  病理标本的制作  空白组及对照组分别取10只幼鼠，治疗组取20只幼鼠，均于生后第17天颈椎脱臼处死，摘除眼球并标记方向。具体方法为：（1）固定：摘除的眼球放入4％多聚甲醛溶液中固定24 h。（2）脱水、透明：梯度酒精脱水、二甲苯透明。（3）浸蜡，切片：连续切片，厚度6 μm，尽量避开视乳头周围。切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位平面。（4）贴片：将切片在温水中展平整后用载玻片贴上。

    视网膜新生血管内皮细胞核计数：计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目，统计平均每眼球每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核数。计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有紧密联系的血管内皮细胞核，不包括玻璃体腔内其他与内界膜无联系的血管内皮细胞核。

    1.3  统计学方法  所有数据资料采用均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用SPSS 12.0统计软件的t检验进行统计学分析。

    2  结果

    2.1  视网膜铺片  正常对照组在生后第12天(鼠龄12天)视网膜血管自视盘发出，向四周呈放射状均匀分布，管径较粗，分支良好，周边部视网膜血管网结构清晰，可见到少量无灌注区（图1a）；在生后第17天时(鼠龄17天)视网膜血管基本成熟，自视盘发出的大血管向四周呈放射状均匀分布，直至视网膜周边部，有些在周边部仍较粗，形成沿周边部视网膜走行的弓形血管。全部视网膜血管分深浅两层，浅层血管呈放射状分支形态，深层血管呈多角形网状形态，两层血管通过螺旋血管互相连接(图2a)。给氧对照组暴露于高氧环境5天后幼鼠(鼠龄12天)视网膜血管管径变细，分支减少，走行僵直，中央部视网膜可见大片无灌注区，周边部视网膜仍可见部分小血管结构(图1b)；出氧箱5天(鼠龄17天)后可见大量的视网膜新生血管，血管密度较正常对照组明显增高，血管分布紊乱，走行不规则，形态异常(图2b)。治疗组血管密度较其给氧对照组明显下降(图2c)。

    2.2  视网膜新生血管细胞核计数  新生鼠眼球经石蜡包埋、行6 μm切片并常规HE染色后，可清楚地辨明眼球的各层结构，亦证实了视网膜铺片的结果。10只正常对照组生后第17天新生鼠20眼300张组织切片中，未发现或仅在极少数切片中见到突破视网膜内界膜长入玻璃体的血管内皮细胞核，平均每张切片中新生血管内皮细胞核数为(0.35±0.14)个(图3a)。给氧对照组10只生后第17天新生鼠20眼300张组织切片中，可见较多突破视网膜

    内界膜的血管内皮细胞核，有些单独出现，有些成簇出现，平均每张切片中新生血管内皮细胞核数为(27.5±3.10)个(图3b)，与正常对照组相比差异有显著统计学意义(t=-39.177，P＜0.001)。表明该视网膜新生血管动物模型诱发成功，同时在一些切片上还能看出这些血管内皮细胞核邻近深层视网膜血管，证实这些血管内皮细胞来源于视网膜而非玻璃体或眼部其他组织。治疗组生后第17天新生鼠10眼300张组织切片中，可见突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目为(5.09±0.74)个(图3c)，较其对侧眼明显减少，两组相比差异有显著统计学意义（t=-37.437，P＜0.001）；同时也较给氧对照组明显减少，两组相比有差异有显著统计学意义(t=-31.475，P＜0.001)见表1、图4。表1  不同组视网膜新生血管细胞核计数的比较

    3  讨论

    视网膜新生血管性病变的发病机制及其治疗一直是眼底病领域关注的热点。现有的研究表明：新生血管形成是一极其复杂的生物学过程，在体外模型上的主要步骤包括血管基膜上酶的降解；内皮细胞的趋化、迁移；内皮细胞的有丝分裂；内皮细胞和周细胞相互作用、血管腔形成等。VEGF是近年来确定的一种具有自分泌和旁分泌机制的生长因子，在迄今已发现的多种新生血管刺激因子中，它是唯一与缺氧关系密切，并能特异地促进血管内皮细胞分裂的因子。VEGF是以二硫键相连的寡二聚体糖蛋白，分子量为35～45 kD，有5种异构体(VEGF 121～206)。各异构体与肝素及硫酸肝素的结合能力不同［6～8］，VEGF 121不与肝素结合，为可溶性分泌蛋白;VEGF 145少部分结合肝素;VEGF 165是人体内含量最多的一种，有50%以分泌型存在，其余则与胞膜上含硫酸乙酰肝素的蛋白多糖结合;VEGF 189和VEGF 206与肝素结合活性很高，因其被阻隔在细胞表面的肝素、硫酸肝素及胞外基质中，在细胞外液无游离形式存在，体内活性弱于VEGF 121、VEGF 165。在诸多异构体中，VEGF 121、VEGF 145和VEGF 165均能诱导血管内皮细胞增殖和新生血管形成，但以VEGF 165的活性最高。由于VEGF一般是以游离形式发挥作用，含肝素的糖蛋白可能是VEGF的结合位点，而结合型的VEGF可能是一种储备形式，当机体需要时，通过蛋白水解酶的调节作用，使其释放出来。这提示VEGF的活性是在两个水平上调节的，即在基因水平和蛋白水解酶的调节性释放。

    通常认为生血管形成的过程主要包括以下几个步骤：（1）血管内皮下基膜溶解及内皮细胞活化；（2）内皮细胞向肿瘤组织迁移；（3）内皮细胞增殖；（4）形成血管。基质金属蛋白酶（MMPs）在多个环节中直接和间接地发挥着重要作用。MMPs是一个在结构上具有极大同源性的Zn2+依赖性内源性蛋白水解酶家族，主要功能为分解细胞外基质（ECM），迄今为止至少已发现MMPs有26个成员［9］，根据它们结构和ECM底物特异性可分为6类：（1）间质胶原酶（MMP-1、8）：降解天然Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，是目前已知酶中唯一能在细胞外间隙的中性pH条件下降解天然Ⅰ型胶原三螺旋的酶;（2）基质溶解素（MMP-7、26等）：特异性降解蛋白多糖、纤维联接蛋白、层粘连蛋白;（3）明胶酶（MMP-2、9等）：降解变性胶原分子（明胶）及天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原的活性;（4）膜型-金属蛋白酶（MT-MMPs）：作用于Ⅳ型胶原、明胶，还与MMP-2激活有关;（5）间充质溶解素（MMP-3，10，11，12）;（6）其他MMP。MMPs的主要特性：（1）催化机制依赖于内源性的Zn2+和外源性的Ca2+，在pH中性时表现最佳活性;（2）以潜酶或酶原的形式分泌;（3）酶原可被蛋白酶及有机汞激活，激活过程伴有-10 kDa分子量的减少;（4）所有MMPs的cDNA序列与胶原酶相似;（5）每种MMP可降解一种或多种细胞外基质成分;（6）酶活性可被组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）抑制。

    内皮细胞在基础状态下处于休眠状态并与其下的（包括基膜）及周围的内皮细胞相互连接。在血管生成过程中，MMPs降解ECM为血管内皮细胞的迁移开辟道路，它们可以降解基质、基膜等，使静止的内皮细胞被活化，同时，基质降解后，一些储于基质中的生长因子被释放出来，可进一步刺激内皮细胞增殖，内皮细胞要穿过ECM和基质外的纤维支架。细胞外基质的降解依赖纤溶酶原/纤溶酶系统、组织蛋白酶和MMP等的作用，其中主要是MMP。激活后的每一种MMP对ECM不同分子结构的成分进行降解，合在一起，它们可以降解ECM所有成分。MMP-1可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，MMP-9及MMP-2可降解明胶和Ⅳ、Ⅴ型胶原，并且MMP-2与MMP-1可协同降解Ⅰ型胶原;MMP-3降解明胶、蛋白多糖、纤维连接蛋白及Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅺ型胶原，同时能增强MMP-1和MMP-9的活性。

    近年来人们在研究抗肿瘤药物AE-941中发现，AE-941能防止ＶＥＧＦ和其在人体脐静脉内皮细胞上的受体结合，也会防止ＶＥＧＦ和其在内的主动脉内皮细胞上的受体结合。防止ＶＥＧＦ及其受体结合［9～11］。另有实验结果显示，卡特消对于基质金属蛋白酶ＭＭＰ-2、ＭＭＰ-9和ＭＭＰ-12等酵素在溶解明胶和溶解弹性蛋白方面的活性，具有强力的抑制作用［11～13］。它们可以降解基质、基膜等，使静止的内皮细胞被活化，同时，基质降解后，一些储于基质中的生长因子被释放出来，可进一步刺激内皮细胞增殖。

    本实验我们通过建立氧诱导血管增生性视网膜病变动物模型，玻璃体腔内注射一定剂量的FK 228，观察其是否能够抑制视网膜新生血管形成。视网膜铺片及视网膜新生血管内皮细胞细胞核计数结果显示：治疗组视网膜新生血管形成与其对照组相比均减少，差异有显著的统计学意义(P<0.001)；说明一定剂量的AE-941对视网膜新生血管形成具有明显的抑制作用，这与AE-941在抑制肿瘤新生血管方面的报道是一致的［14～16］。虽然其详细机制还不甚明确，但这足以为我们提供一条控制视网膜新生血管的全新的、大有希望的途径。

    【参考文献】

    1 Nelson AR，Fingleton B，Rothenberg ML，et al.Matrix metalloproteinases：biologic activity and clinical implications.J Clin Oncol，2000，18：1135-1149.

    2 Taraboletti G，Garofalo A，Belotti D，et al.Inhibition of angiogenesis and murine hemangioma growth by batimastat，a synthetic inhibitor of matrix metalloproteinases.J Natl Cancer Inst，1995，87：293-298.

    3 Hoekstra R，Eskens FALM，Verweij J，et al.Matrix metalloproteinase inhibitors：current developments and future perspectives.Oncologist，2001，6(5)：415-427.

    4 Beliveau R，Gingras D，Kruger EA，et al.The antiangiogenic agent neovastat (AE-941) inhibits vascular endothelial growth factormediated biological effects.Clin Cancer Res，2002，8(4)：1242-1250.

    5 Min JH，Yang H，Ivan M，et al.Structure of an HIF-1 alpha-pVHL complex;hydroxyproline recognition in signaling.Science，2002，296(5574)：1986-1989.

    6 Plouet J，Moro F，Bertagnolli S，et al.Extracellular cleavage of the vas-cular endothelial growth factor 189-amino acid form by urokinase is re-quired for its mitogenic effect.J Biol Chem，1997，272：13390-13396.

    7 Hyder S，Murthy L，Stancel G.Progestin regulation of vascular endothe-lial growth factor in human breast cancer cells.Cancer Res，1998，58(2)：392-395.

    8 Leung DW，Cachianes G，Sanzo WJ，et al.Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen.Science，1989，246(4935)：1306-1309.

    9 Park HI，Ni J，Gerkema FE，et al.Identification and characterization of human endometase（matrixmetallo proteinase-26）from endometrial tumer.J Biochem，2000，275（27）：20540-20544.

    10 Falardeau P，Champagne P，Poyet P，et al.Neovastat，a naturally occurring multifunctional antiangiogenic drug，in phase Ⅲclinical trials.Semin Oncol，2001，28(6)：620-625.

    11 Berger F，Jourdes P，Benabid AL.AE-941 (Cartcell) shows a beneficial effect in experimental glioma and is associated with high angiostatin level in treated tumors.Proc Am Assoc Cancer Res，2001，42：724.

    12 Dredge K.AE-941 (AEterna).Curr Opin Investig Drugs，2004，5(6)：668-677.

    13 Gingras D，Nyalendo C，Di Tomasso G，et al.Activation of tissue plasminogen activator gene transcription by Neovastat，a multifunctional antiangiogenic agent.Biochem Biophys Res Commun，2004，320(1)：205-212.

    14 Goi T，Fujioka M，Satoh Y，et al.Angiogenesis and tumor proliferation/metastasis of human colorectal cancer cell line SW620 transfected with endocrine glandsderived-vascular endothelial growth factor，as a new angiogenic factor.Cancer Res，2004，64(6)：1906-1910.

    15 Boivin D，Gendron S，Beaulieu E，et al.The antiangiogenic agent neovastat (AE-941) induces endothelial cell apoptosis.Molecular Cancer Ther，2002，1：795-802.

    16 August Bukowski RM.AE-941，a multifunctional antiangiogenic compound：trials in renal cell carcinoma.Expert Opin Investig Drugs，2003，12(8)：1403-1411.