【摘要】 目的：探求视网膜神经元的最佳分离和培养方法，提高原代培养神经元的纯度及活性。方法：采用新生大鼠视网膜神经元，应用含100mL/L新生牛血清、100g/L F12 Nutrient Mixtures的DMEM培养基进行接种培养，含20g/L B27 SerumFree Supplements的Neurobasal Medium进行维持培养，利用尼氏染色进行神经元鉴定。
结果：培养的神经元生长良好，胞体饱满，突起长。尼氏染色示神经元比例大于90%。结论：采用机械分离法和Neurobasal Medium培养基可以使新生大鼠视网膜神经元得到良好的生长和较高的纯度。
【关键词】 视网膜；神经元；原代培养
Primary culture of retinal neurons of newborn rat
XiaoYing Wu, Di Zhang, ShuangZhen Liu
Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
Correspondence to: XiaoYing Wu. Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To explore the best method of separating and culturing retinal neurons, and to improve purity and activity of primary cultured neurons.METHODS: Primary culture of retinal neurons of newborn rat was performed by Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) with 100mL/L newborn calf serum and 100g/L F12 Nutrient Mixtures. The Neurobasal Medium with 20g/L B27 SerumFree Supplements was used for maintenance culture. Evaluation of neurons was made by Nissls staining.RESULTS: Cultured neurons grew well. They were plump with long processes. The purity of neurons was higher than 90%.CONCLUSION: Primary culture of retinal neurons of new born rat by mechanical separation and Neurobasal Medium is a reliable way to obtain active neurons with high purity.
KEYWORDS: retina; neurons; primary culture
引言
视网膜属中枢神经系统的一部分，由多种不同的神经元组成，各自在视觉信息的接收、加工处理及传导过程中起重要作用。至今人们对视网膜内各种神经细胞结构与功能的了解还不够深入。如果能建立稳定良好的视网膜神经细胞体外培养体系，对于深入研究视网膜内各种细胞成分的结构特征与生物学功能、病理改变过程与机制以及药物反应等十分重要。
1材料和方法
1.1材料
出生后1～3d清洁级SD大鼠，由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。DMEM（Dulbeccos modified Eagles medium）、Neurobasal Medium、F12 Nutrient Mixtures、B27 SerumFree Supplements和谷氨酰胺购自美国Gibco公司。多聚赖氨酸购自美国Sigma公司。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。甲苯胺蓝购自美国Invitrogen公司。接种培养基由DMEM加入100mL/L F12 Nutrient Mixtures、100mL/L新生牛血清、0.06g/L谷氨酰胺、200kU/L青霉素及链霉素配成。维持培养基1由Neurobasal Medium 加入20g/L B27 SerumFree Supplements、0.06g/L谷氨酰胺、200kU/L青霉素及链霉素构成。维持培养基2由Neurobasal Medium 加入20g/L B27 SerumFree Supplements、200kU/L青霉素及链霉素构成。上述溶液过滤除菌后4℃保存备用。
1.2方法
实验前，于每只培养瓶中置入14～15片8mm×8mm大小盖玻片，再加入适量0.05g/L多聚赖氨酸，以能盖住瓶底为限。将培养瓶放入37℃恒温培养箱中过夜。2d取出后吸除多余的多聚赖氨酸，加入少许接种培养基洗涤1次，吸净备用。乳鼠经750mL/L乙醇消毒5min后迅速断头处死，。将取得的视网膜用显微剪剪碎，反复吹打组织块使之变成单细胞悬液，静置后取中上层悬液接种于事先铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，加入适量接种培养基，调整细胞密度至（2～4）×104/cm2。置于37℃、50mL/L CO2的培养箱中培养。24h后用维持培养基1换液1次。3d开始用维持培养基2，1～2d 1/3量换液1次。每天用倒置显微镜对培养细胞的生长状态及形态学变化进行观察。用10g/L甲苯胺蓝作尼氏染色［1］鉴别神经元与非神经元细胞。具体方法如下：40g/L多聚甲醛固定细胞爬片20min。双蒸水洗爬片3次，每次3min。滴加10g/L甲苯胺蓝溶液后置于54℃恒温箱内浸染30～40min。冷却后自来水、双蒸水各洗1次，每次3min。950mL/L的乙醇迅速分化。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察并记录：在高倍视野下，随机取10个视野，计数神经元数和细胞总数，计算神经元比例。计算公式为神经元比例=神经元数/细胞总数。
2结果
2.1大鼠视网膜神经元形态
接种24h后大部分细胞已贴壁，少数细胞长出较短的突起。2～3d后，长出突起的神经元数目进一步增多，突起长度增加，约为自身胞体长度的1/2至1～2倍。神经元胞体饱满、透亮、内无明显颗粒，通常较容易观察到细胞核及核仁。胞体多呈多边形和椭圆形，周围有不同程度的光晕。神经元周围可见非神经元细胞。培养5～6d后神经元突起进一步增多、变长，非神经元细胞逐渐减少。培养7～10d神经元仍生长良好，未见明显崩解死亡迹象，突起长度可达自身胞体直径的10倍以上，并逐渐形成复杂的网络结构（A）。
2.2 神经元鉴定
培养7d大鼠视网膜神经元经尼氏染色后胞质呈蓝紫色，尼氏小体颗粒状，结构清晰。非神经元细胞胞质基本不着色，胞核淡紫色圆形，核仁清晰可辨（B）。神经元比例可达90%以上。
3讨论
视网膜神经元在视觉信息的接收、加工处理及传导过程中起重要作用，对眼科疾病的临床基础研究具有重要意义。通过视网膜神经元原代培养，可以并且容易对研究的条件进行人为的控制，并保持相对恒定，进行一些在体内无法实施的研究内容。神经元体外培养的成活率受许多因素的影响。一般来说，取材动物的年龄越小，成活率越高。多数培养的神经元取自胚胎动物，这主要是因为此时神经元的分离培养是在轴突和树突广泛分支发育之前，神经元不易在分离过程中受到损伤。并且在发育的早期阶段，神经元对靶细胞营养的依赖性较低，结缔组织鞘膜也易于分离干净［2］。但是动物的胚胎年龄难以确定，取材较困难，易被色素上皮污染［3］。生后1～3d的SD大鼠，其视网膜神经节细胞有丰富的分裂像，视网膜分层尚未完成，RGCs存在于内网状层；内颗粒层已经显示出某些细胞的同源性；外网状层尚未形成，光镜下无明显光感受器分化表现；在神经上皮和色素上皮间有明显的裂隙，使视网膜神经上皮容易与色素上皮分离而不被色素上皮污染［4］。
目前，神经元的体外培养应用最多的是含血清的MEM基础培养基，但由于多数培养基是根据非神经元的连续增殖营养所需而设计的，对神经元生长不大合适。并且在神经组织的分离细胞悬液中，一些非神经元细胞是无法完全去除的，包括神经胶质细胞、成纤维细胞等［5］。由于这些细胞在体外能广泛增殖，所以在神经元的长期培养中一般要加入一定量的有丝分裂抑制剂阿糖胞苷等以防止其过度增长［6］。而阿糖胞苷对神经元也有一定的毒性作用，可导致神经元的死亡。我们在神经元培养的早期采用含新生牛血清、F12 Nutrient Mixtures、谷氨酰胺的DMEM作为接种培养基。血清中既含有纤连蛋白、层粘连蛋白等介导细胞贴壁的因子，又含有多种营养物质，在加入了F12 Nutrient Mixtures、谷氨酰胺等添加剂后营养更为全面，能够帮助神经元贴壁，并为其贴壁提供充足的能量。待细胞稳定贴壁后再将培养基逐渐过渡为Neurobasal Medium/B27 SerumFree Supplements无血清培养基进行维持培养。无血清培养基可以抑制非神经细胞的生长，尤其是成纤维细胞明显减少；神经细胞突起分化早、伸展快［7］。维持培养基专为培养神经元而设计，能够满足神经元的特殊营养需求，胶质细胞等在其中不能够持续分裂增殖而逐渐死亡，因此能够纯化神经元。我们使用上述培养基培养的神经元状态良好，密度较高，非神经细胞数量不多，不添加阿糖胞苷也能够获得较高纯度的神经元。
总之，我们对大鼠视网膜神经元原代培养在取材时间的控制以及培养基的配制等方面进行了改进，不但可得到较高纯度的神经元，而且可使神经元生长的质量和数量达到比较理想的状态，满足实验的需要。
【参考文献】
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2郑志竑,林玲.神经细胞培养理论与实践.北京:科学出版社 2002:7779
3 Schwalb JM, Boulis NM, Gu MF. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. JNeurosci1995;18(8):55145523
4 Leak RK, Moore RY. Identification of retinal ganglion cells projecting to the lateral hypothalamic area of the rat. Brain Res1997;770(12):105114
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6 Berg DK, Fischbach GD. Enrichment of spinal cord cell cultures with motoneurons. J Cell Biol1978;77:8398
7丁爱石,王福庄.新生大鼠海马神经元在无血清培养液中的生长特征.细胞生物学杂志 1993;15(2):8992
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