【摘要】 目的：探讨高糖条件下促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）mRNA和蛋白在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的表达。方法：体外培养HUVECs，实验组分别给予22mmol/L葡萄糖作用6,12,24,48,72h,对照组1为生理糖浓度组（5.5mmol/L），对照组2为甘露醇组（与22mmol/L高糖组等渗）。运用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测HUVECs EPO mRNA的表达。采用免疫荧光细胞化学方法测定HUVECs EPO蛋白质的表达。结果：HUVECs在22mmol/L高糖刺激12,24,48h后，EPO mRNA和蛋白表达均显著高于对照组1(P<0.05),72h开始下降。结论：HUVECs在高糖条件下EPO mRNA和蛋白表达增强，且与时间相关。EPO表达增加有可能促进新生血管生成。
【关键词】 促红细胞生成素；人脐静脉内皮细胞；高糖
The effect of high glucose on expression of erythropoietin in human umbilical vein endothelial cells
ShuQian Dong, HuiZhuo Xu, XiaoBo Xia, SiQi Xiong
Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410008, Hunan Province,China
Abstract
AIM:To investigate the effect of high glucose on expression of erythropoietin(EPO) mRNA and protein in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) cultured in vitro.
METHODS: HUVECs were cultured in vitro with high glucose at a concentration of 22mmol/L for 6，12，24, 48,72 hours.The expression of EPO mRNA and protein was detected by semiquantitative reverse transcriptase (RT)polymerase chain reaction (PCR) and immunofluorescence method.
RESULTS:The expression of EPO mRNA and protein in HUVECs to high glucose at a concentration of 22mmol/L for 12,24,48 hours were higher than that in normal. Control group,but at 72 hours the expression of EPO began to decrease.
CONCLUSION: High glucose could increase the expression of EPO mRNA and protein which were timerelated in HUVECs. Expression of EPO mRNA and protein increased in HUVECs after high glucose,which might induce the generation of neovascularization.
KEYWORDS:erythropoietin;human umbilical vein endothelial cell; high glucose
0引言
糖尿病是影响全身各个脏器和组织血管的糖代谢紊乱疾病，其中糖尿病视网膜病变( diabetic retinopathy, DR)是糖尿病的严重慢性血管并发症之一。高血糖引起的血管内皮细胞功能障碍和内皮细胞损伤是糖尿病血管并发症发生的前提。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是调节红细胞生成的必需的细胞因子,且对神经组织损伤有重要的保护作用［1，2］。最新的研究表明EPO参与DR的发病过程，促进视网膜新生血管生长，而且属于独立于血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）之外的一条调控途径［3，4］。我们分析高糖条件下HUVECs EPO的表达情况，为EPO在DR中的作用提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVECs)（湘雅医学院细胞中心）；Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（低糖型）（美国Gibco公司）；新生牛血清（杭州四季青）；Trizol Reagent (美国Gibco公司)；逆转录试剂盒（RT,大连宝生物制品公司）；Taq DNA聚合酶（天根生化）；EPO山羊抗人多克隆抗体（美国SantaCruz公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组 HUVECs用DMEM（低糖型）＋100mL/L, 56℃灭活的新生牛血清，于37℃,50mL/L CO2条件下培养，隔天换液。将传代的HUVECs调整细胞数在1×108个/L,每孔2mL接种于无菌6孔培养板培养，细胞贴壁后，无血清培养液饥饿24h，然后随机分为实验组和对照组。实验组分别给予22mmol/L葡萄糖作用6,12,24,48,72h,对照组1为生理糖浓度组（5.5mmol/L），对照组2为甘露醇组（与22mmol/L高糖组等渗）。所有实验均重复3次。
1.2.2 RTPCR检测EPO mRNA的表达 用Trizol Reagent提取细胞的总RNA,经紫外分光光度计测定波长260,280nm吸光度（A）值的比值（A260/A280），70℃保存备用。设计引物：在Genbank中查出EPO基因和内对照基因甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）的cDNA序列，用软件Primer 6.0在其阅读框内设计引物。所用引物序列均由上海生工合成。EPO引物序列：上游5’GCTCCACTCCGAACAATCA 3’、下游5’GCGTGTCCTGGCATCAAA 3’，PCR产物长度为450碱基对（bp）。GAPDH引物序列：上游5’AATCCCATCACCATCTTCCA 3’，下游5’CCTGCTTCACCACCTTCTTG 3’，PCR产物长度为580bp。以提取的总RNA为模板，加入浓度为10mmol/L上下游引物，运用RTPCR法将总RNA逆转录成cDNA，然后以逆转录产物为模板，以GAPDH为内参进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火35s，72℃延伸40s，共循环30次，最后72℃再延伸8min。PCR反应体系中，省去cDNA者作为阴性对照。PCR扩增反应结束后，分别取出5μL PCR产物，在20g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像，采用Scion Image图像分析软件进行A值定量分析。EPO mRNA的PCR产物相对量＝EPO扩增产物的A值/GAPDH扩增产物的A值。
1.2.3免疫荧光细胞化学检测EPO蛋白的表达 待预先放置在培养板中的盖玻片上细胞贴壁融合后，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，40g/L多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3遍（10min），2g/L TrizonX100通透10min，PBS洗3遍，加兔封闭血清（1∶100），室温下作用30min。滴加山羊抗EPO多克隆抗体（滴度为1∶100），4℃过夜，PBS洗涤，加入荧光标记FICT抗山羊IgG，室温下2h（避光）。PBS洗涤后，直接照荧光照片。荧光显微镜下观察各组内皮细胞中EPO的表达部位及组间差异。染色结果判断：以细胞质出现绿色荧光颗粒为阳性细胞。以PBS代替一抗作为阴性对照。
统计学分析：统计学分析所有数据以±s表示,应用SPSS 11.5 软件,采用单向方差分析(oneway ANOVA)检验和最小显著差异（LSD）t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1高糖对HUVECs EPO mRNA表达的影响 采用RTPCR方法检测EPO mRNA的表达，结果发现在580bp处各组内参照GAPDH mRNA表达条带均明显可见，而450bp处各组EPO mRNA表达信号强度不同，且随高糖干预时间的延长，表达逐渐增强。对照组仅见微弱EPO mRNA表达条带，高糖干预12h后条带变亮，24及48h条带仍较亮，72h条带减弱。经Scion Image图像分析软件分析发现：对照组1 （0.32±0.02）和对照组2 （0.34±0.02）之间表达差异无统计学意义，说明高糖条件下EPO表达的增加与渗透压无关。与对照组1 （0.32±0.02）相比，12h组EPO mRNA表达（0.65±0.02）明显增强，48h组EPO mRNA（0.76±0.02）表达最强，72h组EPO mRNA（0.32±0.03）表达减弱（图1,2）。
2.2高糖对HUVECs EPO蛋白表达的影响 免疫荧光细胞化学染色结果显示，对照组及6h高糖组HUVECs中仅见微弱的EPO蛋白阳性染色，呈淡绿色，而12,24,48h高糖组HUVECs EPO蛋白阳性染色明显加深， 呈绿色荧光颗粒，位于细胞质中。对照组1与对照组2之间表达无明显差异。与对照组1相比，高糖干预12h后EPO蛋白表达明显增高，24及48h EPO蛋白表达仍维持较高水平，72h稍下降(图3AG)。
图1EPO 的RTPCR 扩增产物的20g/L 琼脂糖凝胶电泳图。M:600 DNA marker，1生理糖浓度对照组, 2甘露醇对照组,3～7分别为22mmol/L高糖干预6,12,24,48,72h（略）
图2统计分析灰度EPO mRNA扩增产物条带与GAPDH mRNA扩增产物条带的相对比值。对照组2,实验6h组，12h组，24h组，48h组，72h组与对照组1相比，aP<0.05（略）
3讨论
由于DR严重危害视力，一直是眼科临床关注的热点。研究表明内皮细胞功能障碍是血管病变的关键因素,各种损伤刺激危险因素均首先作用于血管内皮细胞而EPO可减弱高糖诱导的内皮细胞的凋亡［5］。我们采用HUVECs作为研究对象，研究高糖对其EPO mRNA和蛋白质表达的影响。高糖及缺血缺氧的视网膜可产生多种生长因子如VEGF，刺激新生血管生成，造成视网膜增殖性改变［6，7］。近年在临床上应用抗VEGF疗法取得一定疗效［8］，但抑制VEGF通路后并不能完全抑制视网膜新生血管的产生，人们发现EPO是一个独立的促视网膜新生血管形成的因子［3］。人类EPO基因位于7号染色体长臂22区，编码的多肽链包括193个氨基酸。经过转化其活性蛋白为165个氨基酸多肽组成的糖蛋白，分子量为30.4kDa。EPO有4个糖基化链包括3个氮末端N糖基(分别位于天冬氨酸Asp24,Asp38,Asp83) 和一个丝氨酸O糖基(位于Ser126)。它们的主要成分是甘露糖、岩藻糖、唾液酸等低聚糖。其存在对EPO合成后的分泌及体内、外生物活性的发挥都具有重要意义。其中唾液酸的作用尤为重要，它能够覆盖N糖基中的半乳糖残基，并阻断后者与肝细胞表面半乳糖受体结合所引起的EPO灭活，故唾液酸的存在是EPO在体内发挥生物活性的必要条件［9］。传统认为EPO主要调节红系祖细胞的增殖、分化和以后的逐渐成熟。然而近来在一些非造血组织也发现有EPO的表达，例如中枢神经系统、内皮细胞、实体瘤、肝脏和子宫［1014］。人们开始对各个作用位点EPO的作用途径和效应进行大量研究，其中EPO的血管形成作用引起研究者极大的兴趣。研究发现［15］无论肿瘤细胞是否表达EPOR，EPO都可间接通过促进肿瘤新生血管生成，增加瘤内微血管密度，加速其肿瘤生长。主要机制为EPO诱导内皮细胞增殖，阻断H2O2诱导的细胞凋亡，激活细胞外信号调节激酶信号途径，上调下游抗凋亡蛋白BclxL的表达,增加内皮祖细胞循环。以往研究表明［1014］，EPO的生成和分泌由组织供养量调控。当细胞缺氧时，低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α,HIF1α）途径被激活，使得缺氧依赖基因EPO大量转录。HIF家族的每个成员HIF1α，HIF1β，HIF3α对调节EPO都发挥着重要的作用。大量刺激可以激活HIF途径增加EPO的表达，例如缺氧、低血糖、细胞内Ca2+增多等。贫血、胰岛素的释放和一些细胞因子如胰岛素样生长因子（IGF）、肿瘤坏死因子α（TNFα）,白介素1β (IL1β)，白介素6（IL6）也能引起EPO表达的增加［16］。我们实验运用RTPCR和免疫荧光细胞化学技术检测HUVECs EPO的表达。结果显示，正常条件下HUVECs仅见微弱的EPO mRNA和蛋白的表达，高糖干预12h明显增加，24,48h仍维持较高水平，72h下降。本研究结果表明，内皮细胞存在EPO基因的表达，而且高糖干预后表达明显上调，并与时间相关。高糖能直接增加血管内皮细胞EPO mRNA及蛋白水平的表达。因此我们推测：糖尿病患者高血糖能刺激内皮细胞产生并分泌EPO，EPO一方面通过促内皮细胞分裂与迁移作用促进视网膜新生血管的新生，另外可通过抑制内皮细胞凋亡促进视网膜新生血管的形成。运用EPO抑制剂有可能抑制DR新生血管的发展［17］。
图3HUVECs EPO免疫荧光细胞化学染色像(白箭头表示阳性表达SP×200）（略）
A：对照组1为生理糖浓度组；B：对照组2为甘露醇组；C：实验组（给予22mmol/L葡萄糖作用）6h组；D：实验12h组；E：实验24h组；F：实验48h组；G：实验72h组
总之，HUVECs在高糖条件下可诱导EPO基因的表达上调，这为进一步研究EPO促进新生血管的生成奠定了基础。
[1] [2] 下一页 |
