【摘要】 目的:研究大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜组织中的表达。方法:采用角膜碱烧伤法对60只Wistar大鼠制作角膜新生血管模型。裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管生长情况,免疫组化法检测碱烧伤后不同时间角膜组织中CD105的表达。结果:大鼠角膜碱烧伤后2d角膜新生血管开始形成，3～7d生长旺盛，新生血管面积达到最大，10～14d角膜新生血管生长停滞。在新生血管化角膜组织中,CD105于3～7d表达最明显,14d后表达微弱。结论:大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜组织中有明显表达。
【关键词】 CD105;角膜；新生血管化;碱烧伤
The expression of CD105 in neovascularized cornea of rats after alkali burn
Yan Li，LiKun Xia
Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Abstract
AIM: To study the expression of CD105 in neovascularized cornea of rats after alkali burn.
METHODS: corneal neovascularization(CNV) was induced in vivo by alkaline cauterization of the central cornea in 60 wistar rats. CNV was observed with slit lamp microscope. The expression of CD105 was investigated with immnuohistochemical method in rat cornea at different time.
RESULTS: The CNV was found from 2 days after alkali burn in the rat cornea. The CNV area peaked at 7 days and stagnated from 10 to 14 days. In neovascularization of corneal tissue, CD105 protein peaked at 7 days after cautery, decreased after 7 days, and significant decreased after 14 days.
CONCLUSION: This study suggests that CD105 express significantly in neovascularized cornea of rats after rats cornea were alkaline burned.
KEYWORDS: CD105; cornea；neovascularization; alkali burn
0引言
正常的角膜光滑透明，而角膜缘却有丰富的血管网，毛细血管由角膜缘处进入角膜周边部1～2mm 以上即可认为是角膜新生血管(corneal neovascularization, CNV)。多种刺激因素能使毛细血管由角膜缘处向角膜方向爬行生长。CNV 可破坏角膜正常微环境,使眼前节相关免疫赦免偏离消失，不仅使角膜透明度下降,影响视力,也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素[1,2] 。目前CNV发病机制还不十分清楚。最近有研究表明CD105参与了血管生成过程,在新生血管组织中的表达尤为丰富。我们观察CD105在碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管模型中的表达情况,为探讨CNV的发病机制提供依据。
1材料和方法
1.1材料 大鼠60只,体质量220～250g (中国医科大学盛京医院动物实验中心提供) ,随机抽取 30只作为正常对照组,余下30 只为角膜新生血管组即实验组。实验组经水合氯醛腹腔注射麻醉(3mL/kg)及丁卡因滴眼表面麻醉,用直径3.0mm 的圆形滤纸片浸入1mol/L NaOH 溶液中约10s,饱和后取出,轻触干滤纸以吸去过多的碱液,将滤纸片贴敷于大鼠右眼角膜中央,50s后移去,立即用无菌生理盐水冲洗结膜囊2min,氯霉素滴眼液滴双眼,3次/d。对照组用生理盐水代替烧碱，余同实验组，术后以氯霉素滴双眼,3次/d。
1.2方法 裂隙灯下每天观察碱烧伤后角膜新生血管生长情况,在水合氯醛麻醉下用裂隙灯数字图像处理系统照相,并用圆规测量长入角膜的新生血管长度(以连续且弯曲度小、并与角膜缘切线垂直的新生血管长度为准) 。计算新生血管生长面积公式: S=C/12×3.1416×[r2–(r–l)2], S为角膜新生血管生长面积, C为角膜新生血管累及角膜的圆周钟点数,l为角膜新生血管长度, r=3mm(大鼠角膜半径)。在1，3，5，10，14d分别从对照组及实验组随机抽取5 只大鼠过量麻醉处死,用免疫组织化学染色法分别检测两组各时间点CD105的表达。将大鼠处死后,迅速摘除右眼带1mm宽巩膜的角膜组织,放入40g/L多聚甲醛磷酸缓冲固定液,固定48h ,常规逐级梯度乙醇脱水、二甲苯透明、60 ℃石蜡液浸蜡,垂直包埋,4μm连续切片, HE 染色。以免疫组织化学SP 法进行染色(CD105一抗由武汉博士德生物技术有限公司提供,SP试剂盒及DAB显色剂均由北京中杉公司提供) ,用PBS 作阴性对照。光学显微镜下观察并照相。将CD105的染色结果输入计算机,采用彩色图像分析系统(HMIAS2000 型全自动彩色图像分析系统) ,每张切片随机选取5 个高倍(40×)视野,测量CD105 免疫组化染色的平均吸光度值(average assorbance,A) ,半定量分析CD105的表达。
统计学分析：所有计数资料以均数±标准差表示,两组间差异显著性检验用SPSS 13.0数据包进行t检验,P<0.05为显著性检验的标准。
2结果
2.1形态学观察 碱烧伤后1d ,角膜缘血管网怒张 ,角膜中央水肿、混浊。1，3，5，7，10，14d角膜缘有新生血管，面积分别为0，17.1±0.82，19.8±1.5，37.6±1.2，36.4±1.3和28.4±1.1mm2,而对照组为0。其中3～7d CNV面积增长最快，新生血管伸出分枝且相互吻合,第7～10d时CNV面积最大,几乎布满整个角膜（图1）。其后10～14d时 CNV面积增长减慢，新生血管伸长变细 ,部分血管开始闭缩退化。
2.2角膜CD105的表达 CD105在角膜上皮、新生血管内皮细胞中染色阳性均呈棕黄色,着色深浅表示阳性程度大小。对照组角膜上皮可见少量 CD105表达，略呈棕黄色（图2A）。实验组自角膜碱烧伤后1d开始，CD105表达增加，3d开始CD105表达明显增强 , 5～7d表达达到高峰，CD105主要表达于角膜上皮全层和角膜基质内新生血管的血管壁上,同时角膜基质内可见大量炎性细胞浸润（图2B），10～14d CD105阳性表达开始减弱（图 2C）。PBS阴性对照见图2D。图像分析系统对烧伤后不同时期角膜 CD105阳性免疫组织化学染色的平均吸光度值进行半定量分析,结果见表 1。
3讨论
角膜新生血管形成是感染、创伤等病理情况下的严重并发症 ,也是使角膜移植排斥率升高的主要原因 ,严重危害视功能 ,因此一直是眼科界着力解决的焦点问题。众多研究表明 ,新生血管性疾病的实质是血管形成促进因子表达增加 ,从而刺激新生血管生长。参与 CNV增殖因子众多,目前在新生血管旺盛的组织中发现一种新的蛋白CD105，研究表明其参与了新生血管的生成。CD105又名endoglin，是转化生长因子TGFβ受体复合物的组成部分，通过调节TGFβ的生物学功能来发挥其促血管生成的作用。主要方式为通过对抗TGFβ的抑制血管生成的作用促进血管增殖和分化[3]。Wikstrm等[4]提出CD105主要在未成熟血管表达，CD105仅在处于增殖状态的血管内皮细胞上高度表达，而在大血管及正常组织血管内皮细胞上呈低表达或不表达[5]。Warrington 等[6] 证明,在人和鼠的血管内皮细胞中,CD105 能对抗TGFβ1 的抑制作用,而且正常细胞水平的CD105 对新血管的生成是必需的。目前已有相关实验证实CD105单抗能抑制肿瘤内新生血管从而作为肿瘤治疗的靶点[7]。各相关实验均证实CD105的表达促进了新生血管的发生，抑制CD105的表达则抑制了新生血管的形成。近年来Grisanti等[8]发现CD105在脉络膜新生血管中有表达并且随着新生血管增加表达增强。徐剑峰等[9]在激光诱导的脉络膜新生血管中发现CD105明显表达并且与CNV的表达一致[10]。
图1大鼠角膜碱烧伤后7d，角膜中央混浊水肿，新生血管由角膜缘向角膜中央伸展（略）
图2大鼠角膜碱烧伤后免疫组织化学染色(×40)（略）
A:对照组中仅见少量CD105表达；B：实验组碱烧伤后5～7d CD105表达达到高峰；C：实验组碱烧伤后10～14d CD105阳性表达开始减弱；D：PBS阳性对照
本研究结果显示，碱烧伤后1～3d，CD105主要在角膜上皮及基质层新生血管组织中表达，4～7d角膜组织内CD105表达增强，而10d以后表达开始减弱，与组织学形成CNV过程一致，即烧伤后3～7d新生血管生长最为旺盛，10～14d生长减慢，血管开始退化。而CD105在正常角膜中几乎无或微弱表达。由此表明 ,CD105参与了新生血管形成过程，且其表达可以反映 CNV增生的活跃程度。由于 CNV的病因较复杂,目前临床治疗效果不理想。根据新生血管形成过程中的特点制定靶向分子治疗将是一种独特的方法。尽管目前 CD105的作用机制并不是十分清楚且临床应用还需进一步探索,但它为临床治疗新生血管性疾病带来希望。
表1大鼠角膜碱烧伤后CD105平均吸光度值（略）
aP<0.05 vs 对照组
【参考文献】
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3 Duff SE, Li C, Garland JM, et al. CD105 is important for angiogenesis: evidence and potential applications. FASEB J2003;17(9):984992
4 Wikstrm P, Lissbrant IF, Stattin P, et al. Endoglin (CD105) is expressed on immature blood vessels and is a marker for survival in prostate cancer. Prostate2002;51(4):268275
5 Li C, Guo B, Wilson PB, Stewart A, et al. Plasma levels of soluble CD105 correlate with metastasis in patients with breast cancer. Int J Cancer 2000;89(2):122126
6 Warrington K, Hillarby MC, Li C, et al. Functional role of CD105 TGFbeta1 signalling in murine and human endothelial cells. Anticancer Res2005;25(3B):18511864
7 Muoz R, Arias Y, Ferreras JM, et al. Targeting a marker of the tumour neovasculature using a novel antihuman CD105immunotoxin containing the nontoxic type 2 ribosomeinactivating protein nigrin b. Cancer Lett 2007;256(1):7380
8 Grisanti S, Canbek S, Kaiserling E, et al. Expression of endoglin in choroidal neovascularization. Exp Eye Res2004;78(2):207213
9徐建锋,王雨生. CD105与脉络膜新生血管.国际眼科杂志2008;8(1): 126128
10 Xu J, Wang Y, Yang X, et al. Correlation of CD105 and vascular endothelial growth factor in laserinduced choroidal neovascularization in rats. Eye Science2006;22(3):166174
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