作者：林旭初 惠延年 孟浩 张勇杰 金岩
作者单位：1(710032)中国陕西省西安市,第四军医大学西京医院眼科；２(530021)中国广西壮族自治区南宁市,解放军303医院眼科；３(710032)中国陕西省西安市,第四军医大学口腔医院组织工程研究中心
【摘要】目的：制备低抗原性、保留天然角膜结构的组织工程角膜支架材料。方法：对猪角膜进行反复冻融联合酶消化，最后冷冻干燥，观察其组织学特征。结果：制备的脱细胞猪角膜基质的细胞成分能被有效去除，材料保留了利于角膜上皮生长的基底膜和有序排列的网状的基质胶原结构，有一定的强度和韧性。结论：采用反复冻融联合酶消化、冷冻干燥法能获得一种无细胞的组织工程角膜支架材料。
【关键词】 生物衍生材料 脱细胞角膜基质 组织工程
Preparation and observation of the histological structure of the acellular porcine corneal stroma
Xu-Chu Lin1,2,3, Yan-Nian Hui１, Hao Meng１, Yong-Jie Zhang３, Yan Jin３
Foundation item: Supported by the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No.2005AA205241)
1Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China;2Depar- tment of Ophthalmology, No. 303 Hospital of Chinese PLA, Nanning 530021, Guangxi Province, China; 3Research and Development Center for Tissue Engineering, College of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
Abstract AIM: To prepare the scaffold of the tissue engineering cornea with the lower antigen and native structure of corneal stroma.METHODS: The acellular porcine corneal stroma (APCS) was prepared by the means of enzymatic digestion, freezing and thawing and lyophilization, and the histological structure of APCS was observed. RESULTS: The cells in the porcine corneal stroma could be removed effectively. The APCS retained the basement membrane. The structure of stromal collagen was ordered and tough. CONCLUSION: The APCS prepared by the means of enzymatic digestion, freezing and thawing and lyophilization is a kind of tissue engineering corneal scaffold derived from biologic materials. It has the character of the lower antigen and possessing the native structure of the corneal stroma to facilitate the growth of the seed cells.
· KEYWORDS: biologic derivation materials; acellular corneal stroma; tissue engineering
0引言
为解决临床角膜移植的供体不足和术后的排斥反应，组织工程角膜的研究有着重大的医学价值，组织工程角膜的核心就是要形成支架材料和种子细胞的复合体，在该复合体中，支架起着引导细胞生长的重要作用，因此理想的支架材料的获得对组织工程角膜的研究起着很大的推动作用。目前的组织工程支架材料有人工合成高分子、天然高分子和生物衍生材料等几大类。由于生物衍生材料来源于天然的组织，保留了原有组织的三维立体结构和细胞外基质，其保留的的化学信号可诱导和促进种子细胞的生长和分化，因此使用这类材料作为组织工程支架材料有一定的发展前景，目前用其作为组织工程角膜支架材料的研究也在兴起，对材料的制备、保存方法已有多种报道。我们采取反复冻融联合酶消化法，对猪角膜进行系统脱细胞处理，并观察其组织学特征，以明确此种方法能否脱尽角膜组织中的细胞成分以减少材料的免疫原性，同时又能保存天然角膜的一些结构特征以利于种子细胞的生长，为获得理想的组织工程角膜支架材料提供一定的实验依据。
１材料和方法
1.1材料 用本地屠宰场的猪，无眼疾，雌雄不限，摘取刚处死的猪整个眼球，用含抗菌素的磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤，手术显微镜下切取约1/2厚的前板层角膜，三蒸水漂洗后，37℃下，置于2.5g/L的胰酶中消化30min(反复震荡)，三蒸水震荡漂洗，放入-196℃液氮中快速冷冻15min，取出后37℃水浴快速复温解冻，上述冻融过程重复3次，然后置于DNA-RNA酶中消化（667μkat/L）1h，三蒸水震荡漂洗，将材料置于低温冰箱（-80℃）预冻，转入冷冻干燥机中，真空干燥，持续16h左右。冻干的角膜材料，密封于无菌塑料包装袋中，钴60消毒，保存备用。
1.2方法 取冻干的角膜基质行100g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后行常规HE染色。另取冻干的脱细胞角膜基质常规石蜡切片，脱蜡水化后，用5g/L的高碘酸水溶液还原15min，蒸馏水洗5min，然后席夫氏试剂染色15min，再蒸馏水水洗分化10min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。在25g/L戊二醛溶液中固定制备的角膜基质，用0.1mol/L磷酸缓冲液反复冲洗，10g/L锇酸固定，乙醇梯度脱水，液态CO２ 临界点干燥，离子喷镀机作金离子镀膜，在扫描电镜（JEOL JSM-6700F）下观察材料的前弹力层面和中间基质面的超微结构并照相。
２结果
制备的脱细胞角膜基质材料大体看呈白色，上皮面微凸，复水后韧性增加，能耐受缝线的切割。HE切片见细胞完全脱尽，基质表面的前弹力层呈连续的红色带状结构，基质胶原结构呈疏松的网状，但无明显的断裂，保留了角膜胶原的束状有序的排列（图1A），PAS染色见前基质表面基底膜存在（图1B），扫描电镜显示材料靠近上皮面的细胞脱尽，前弹力层表面平滑，保存了基底膜样结构，局部放大呈现毛毡样外观，有沟、嵴及孔径不等的微孔样结构（图1C），而扫描电镜显示基质面呈现出与前弹力层面完全不同的疏松的网状结构，未见细胞成分残留（图1D）。
３讨论
生物衍生材料经过多步骤脱细胞处理，组织中的可溶性蛋白及细胞成分被去除，保留下来的是具有完整外观形态和组织学超微结构的不溶性基质成分，大大降低了抗原性和病原性，生物相容性好，同时由于保留了原有组织的三维立体结构和细胞外基质的主要成分如胶原、弹性蛋白、非胶原糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖等，其保留的的化学信号可诱导和促进种子细胞的生长和分化。因此，利用生物衍生材料作为TE支架材料的研究取得了很大进展，如脱细胞的皮肤真皮组织、神经组织、膀胱组织、血管组织等作为相应的组织工程支架的研究都取得了良好的效果。利用生物衍生材料作为角膜组织工程支架的研究已有报道， Amano等[1]异种（猪）角膜基质为载体培养角膜内皮细胞，细胞能够在基质载体上贴附生长，具有正常角膜内皮细胞的超微结构。吴静等[2]以异种浅层角膜基质片作为载体, 通过体外培养同基因角膜缘上皮细胞, 再将其移植于损伤的角膜上，实验结果证实体外培养的角膜上皮组织与生理状态下的角膜上皮组织相近, 动物移植后角膜透明，上皮愈合。异种天然角膜基质来源丰富，拓展了TE角膜支架材料的来源，并且其组织结构、物理性能更接近自然角膜。
目前，国内外以牛、猪等大型哺乳动物的角膜作为支架材料研究较多，但这些研究有的没有对角膜基质部分进行
图１ 猪无细胞角膜的形态 A：细胞完全脱尽，基质表面的前弹力层呈连续的红色带状结构，基质胶原结构呈疏松的网状，无明显的断裂，胶原呈束状有序排列（HE×200）；B：前基质表面基底膜存在（PAS×400）；C：靠近上皮面的细胞脱尽，前弹力层表面保存了基底膜样结构(SEM×50)；D：基质面呈现出与前弹力层面完全不同的疏松的网状结构，未见细胞成分残留(SEM×50)
系统的脱细胞处理[1,2]，基质组织中的可溶性蛋白及细胞成分还存在，因而具有一定的免疫原性；有的是采取化学去垢剂联合酶消化法对天然角膜基质进行脱细胞处理[3，4]。由于不同的脱细胞方法对生物衍生材料的结构和物理、化学性能会产生不同的影响，进而影响到材料的生物相容性。材料中残留的化学去垢剂可能对细胞产生毒性，影响种子细胞与支架材料的复合，为了避免这些不利因素对材料的性能的影响，我们采用了反复冻融的物理方法联合酶消化法来处理材料，组织学观察表明采用这种方法同样达到了较彻底的脱细胞的效果。另外，由于角膜的基底膜是促进角膜上皮生长和黏附牢固的一个重要结构，它由丰富的Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和少量纤维连接蛋白构成，长期的角膜上皮缺损都伴有基底膜的异常和缺失[５]，在早期组织工程人工合成的角膜支架材料的应用中，移植的材料表面往往不能完整的上皮化，引起植片感染，使材料的应用受到限制[6]，而有的研究发现使合成材料表面的形态模拟天然角膜基底膜，则有利于角膜上皮的移行、黏附和增殖[7],因此为使支架材料能促进角膜上皮细胞的生长，一些合成材料表面要用胶原、层粘蛋白等成分修饰[8]。在角膜脱细胞过程中，为尽量保存基质表面基底膜的完整性，我们缩短了胰酶消化时间，同时采取快冻、快融的冻融法[9]。能显示基底膜的PAS染色和电镜观察结果证实处理后的角膜基质保留了前弹力层面的基底膜结构。基底膜的存在为角膜上皮在材料表面的尽快生长创造了条件，材料体内移植后，上皮能正常生长覆盖在其表面，就可隔绝各种水解酶对材料中胶原成分的降解，使材料不致降解过快，为材料在体内的改建赢得了时间。最后采取的冷冻干燥处理，一方面能进一步减少材料中的抗原成分，另一方面能形成多孔疏松的网状结构，利于营养物质的交换和角膜的基质细胞的长入，从而也有利于支架材料的改建；再次，使材料易于保存运输，不需特殊保存条件。
该实验结果表明采用反复冻融联合酶消化、冷冻干燥法制备的生物衍生材料－脱细胞角膜基质，细胞成分能被有效去除，因而是低免疫原性，同时保留了利于上皮生长的基底膜结构和基质胶原的有序的排列，材料有一定的强度和韧性，这些天然角膜的结构是各种化学诱导信号，有利于种子细胞沿支架生长并向角膜各种细胞分化，细胞在支架上良好的生长并发挥各自的功能，才能保证支架能与受体角膜整合并逐渐被改建而透明化，因而从这个角度而言，采用该方法制备的脱细胞角膜基质可考虑作为组织工程角膜支架材料，当然其有效性还有待更深入的实验研究。
【参考文献】
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