作者：蒋丽　张明昌   

　　作者单位：（430022）中国湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科

　　【摘要】目的：研究（nuclear factor，NF）2κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(NF-B Inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞（human pterygium fibroblast，HPF）增殖的影响,寻找辅助治疗和预防翼状胬肉复发的新方法。方法：取人翼状胬肉标本进行体外贴壁细胞常规培养，取第3～6代细胞进行试验。（1）免疫组化法染色结合细胞生物学特征鉴定成纤维细胞；（2）不同浓度PDTC (2.5，5，10，20，40μmol/L)干预成纤维细胞24，48，72h后, MTT法检测细胞生长抑制率；（3）免疫细胞化学法分别检测PDTC干预48h后HPF增殖细胞核抗原 (PCNA)的表达情况。结果：体外培养的翼状胬肉细胞经免疫组化染色可见波形蛋白表达阳性，结合细胞生物学特性可以确定为成纤维细胞。MTT实验表明，随着PDTC干预浓度的增大和时间延长，成纤维细胞生长抑制率增加(P <0.05)，在2.5-40μmol/L浓度作用24-72h，PDTC可呈剂量和时间依赖性。PDTC干预后PCNA蛋白表达均下降。当PDTC的浓度在5，10，20，40μmol/L范围内能浓度依赖性地抑制细胞表达PCNA(P <0.05)。 结论：PDTC对体外培养的HPF细胞有抑制作用，在一定浓度和时间范围内抑制作用呈剂量与时间依赖性。

　　【关键词】  吡咯烷二硫氨基甲酸　翼状胬肉　成纤维细胞　增生抑制

　　Effect of pyrrolidine dithiocarbamate on proliferation of human pterygium fibroblasts

　　Li Jiang, Ming-Chang Zhang

　　Department of Ophthalmology, Union Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

　　Abstract AIM: To study the effect of pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), a potent inhibitor of NF2κB, proliferation and apop- tosis of human pterygium fibroblasts(HPF)，inculture and search for a new method to prevent the recurrence after pterygium surgery.  METHODS：The primary culture and subculture of HPFs were established in vitro. The third to sixth passage of HPFs were used in next steps:(1) HPFs were identified by the immunocyte to chemical method of SABC. (2) HPFs treated with PDTC （2.5,5,10,20,40μmol/L) for 24,48,and 72 hours, respectively. MTT assay was used to evaluate the cell proliferation inhibitory rate. (3）Immunocyte chemical method were used to analyze expressions of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) , respectively after HPFs being treated with PDTC for 48 hours. RESULTS: The expression of vimentin in cultured cell was positive and the HPFs were identified. The proliferation inhibitory rate of PDTC on HPFs increased as incubation time and concentration increasing (P<0.05). Administration of 2.5-40μmol/L PDTC for 24-72 hours could significantly inhibit HPF proliferation in a dose-and time- dependent manner. CONCLUSION：The inhibition effect of PDTC on HPFs is significantly, which is dose- and time-dependent.

　　· KEYWORDS: PDTC; human pterygium fibroblast; prolifera- tion

　　0引言

　　翼状胬肉是较为常见的疾病，其发病机制仍不十分清楚。它以新生的纤维血管组织自球结膜生长侵入角膜为特点。治疗翼状胬肉的手术方法较多,但均不能有效地降低其复发率，因此寻找有效、副作用少的治疗方法是许多学者所面临的研究课题。PDTC已广泛用于体外培养的人视网膜色素上皮细胞的增生及人肺腺癌细胞A549细胞的生长抑制作用等方面的研究。核因子2κB（NF2κB）是一种重要的核转录因子，广泛存在于真核细胞内，是机体细胞间信号传导通路的重要因子[1] 。研究发现，NF2κB活化后参与多种肿瘤的形成与发展[1]，在肿瘤组织中呈持续激活状态[2]。吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）是NF2κB特异性阻断剂，可抑制其活性[2]。翼状胬肉具有类似肿瘤的增生特点,但PDTC是否对翼状胬肉有作用尚待研究。为此，我们利用体外培养的翼状胬肉成纤维细胞作为实验对象，观察PDTC对其是否具有抑制作用如下。

　　1材料和方法

　　1.1材料 体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞，DMEM培养基（Gibco 公司），新生牛血清（Gibco 公司），1∶250胰蛋白酶、PDTC及噻唑蓝（MTT）（Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司），小鼠抗人角蛋白及波形蛋白单克隆抗体、小鼠抗人PCNA单克隆抗体为武汉博士德公司产品。胬肉组织标本为本院眼科手术切除组织，采用组织块培养法原代接种1d后，观察组织块贴壁情况、培养液色泽、细胞生长状况和形态特征等。48h后观察有细胞从组织块周围爬出（图1），每3～4d更换1次培养液,待细胞生长汇合至80%后以2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，按1∶3分种传代。取传代细胞接种于预置盖玻片的6孔板，待细胞长满盖玻片,取出用无水乙醇+冷丙酮1∶1混合固定15min，风干后HE染色（图2），并以抗波形蛋白和角蛋白抗体行免疫组化鉴定（图3）。

　　图1 HPF原代细胞组织片的边缘可见“毛刷状”缘，细胞呈火焰状或放射状延展，轮廓清晰，胞体透亮(×100)

　　图2 细胞波形蛋白表达阳性，呈现与成纤维细胞长轴方向一致棕黄色网状或束状结构（SP×200）

　　图3 传代细胞轮廓清晰，呈扁平多边状的上皮形态，胞内为淡红色，胞核边界清晰，有的可见“双核”(HE×200)

　　1.2方法

　　1.2.1HPF生长抑制率检测 HPF细胞用含100g/L新生牛血清的DMEM培养基，于37℃，CO2培养箱内培养，2.5g/L胰蛋白酶消化传代。取对数生长期HPF细胞按1×104/孔接种于96 孔培养板，每孔加液200μL。设不接种细胞的空白组（调零组）、对照组和PDTC组。24h后换液，对照组不加PDTC，PDTC组PDTC终浓度分别为2.5，5，10， 20，40μmol/L。每个浓度每个时间点设6个复孔。分别于PDTC干预24，48，72h加入5g/L MTT 20μL/孔，继续培养4h后吸出培养液，加入DMSO150μL/孔，振荡溶解10min，待结晶完全溶解后，在ELX800酶标仪上选择波长490nm，空白组调零，测定各孔吸光度（A），计算细胞生长的抑制率：抑制率=(1-PDTC组A 值/对照组A值)×100%。

　　1.2.2HPF细胞PCNA表达检测 采用免疫细胞化学法。取对数生长期HPF细胞1×108 /L接种于预置盖玻片的6孔板，24h后换液，对照组不加PDTC，PDTC组PDTC终浓度分别为2.5，5，10，20，40μmol/L，培养48h后0.01mmol/L PBS冲洗3次，冷丙酮＋无水乙醇1∶1固定。采用SP法，操作按说明书进行，鼠抗PCNA mAb稀释度为1∶50。胞核呈棕黄色为PCNA阳性，PCNA表达强度用高清晰度彩色图像分析系统（同济科技集团千屏影像公司）测定5个视野的吸光度，取平均值。随机计数（放大倍率20×10）100个细胞数出全部阳性细胞及阴性细胞并列表。

　　统计学处理：实验结果数据计量资料用 表示，MTT抑制率同浓度和时间的关系采用方差分析。不同浓度PDTC对细胞作用结果与对照组的差异用SPSS11.0软件进行t检验。细胞PCNA阳性表达数采用卡方检验。

　　2结果

　　PDTC作用后HPF生长抑制率对照组细胞呈铺路石样、排列整齐贴壁生长;用药组细胞变圆、分布松散，且高剂量组细胞数明显减少。PDTC浓度≥2.5μmol/L时，能显著抑制HPF增生（P <0.05）。在2.5～40μmol/L的浓度范围，抑制强度随浓度升高而加强(P <0.05)。药物作用时间在24～72h抑制强度随时间延长而加强（P <0.05）。48h以上的延长时间并不能使抑制率增加，呈饱和效应动力学特征。在48h浓度为40μmol/L时对HPF增生抑制作用显著（P <0.05），抑制率达到91.0％，72h浓度为20，40μmol/L时对HPF增生抑制率分别达到89.9％，90.6％。随着PDTC干预浓度的增大和时间延长，成纤维细胞生长抑制率增加( P <0.05)，在2.5～40μmol/L浓度作用24～72h范围内，PDTC可呈剂量和时间依赖性。按照各浓度组细胞增生抑制率绘制时间剂量效应曲线(表1)。

　　HPF细胞PCNA表达 细胞阳性表达显示为棕黄色、黄色或浅黄色细小均匀颗粒，分布于整个细胞核；细胞核无着色、胞内呈淡黄色者为阴性对照组。HPF细胞胞核呈棕黄色，PCNA表达强阳性；PDTC干预后，胞核染色变浅，且呈剂量依赖关系( P <0.05，表2，图4)。

　　图4 PDTC组细胞PCNA的表达（SP×200）

　　3讨论

　　翼状胬肉是局部球结膜纤维血管组织呈三角形膜样增生而侵犯角膜的一种眼表疾病,单眼或双眼受累。不仅直接影响美观, 还可由于牵拉而引起眼部不适及角膜散光, 严重者影响视力及不同程度地影响眼球运动，是眼科的常见病、多发病。病理学研究表明，它的主要成分是异常增生的成纤维细胞和新生血管[3]，具有类似肿瘤发生前的性质。纤维增生和新生血管化的范围和程度是预测翼状胬肉切除术后复发的可靠形态学指标[4]。治疗翼状胬肉的手术方法较多，但均不能明显地降低其复发率。目前常采用抗增生药物，如5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、噻替派等单独或联合手术治疗试图降低翼状胬肉术后的复发率，临床观察对延缓胬肉发展具有一定疗效[5]。但这些药物对局部及全身有较大的毒副作用。因此寻找安全、有效的抗增殖药是许多学者所面临的研究课题。抗氧化剂PDTC可抑制NF2κB的p65亚单位，并具有金属螯合作用，是NF2κB特异性阻断剂。在抑制肿瘤的研究中发现其发挥作用的机制可能与下调NF-κB，抑制iNOS,COX-2活性有关[6]，也可能是通过抑制细胞周期蛋白D和E的活性或者刺激caspase-3，caspase-8的活性来降低B c l-x L的水平来诱导细胞凋亡[7]。NF2κB是一种p50、p65异源二聚体，在生理状态下与抑制蛋白IκB在胞浆中结合，处于无活性状态；当细胞受到内毒素、过氧化物、生长因子、白介素、细胞毒素等刺激时，IκB可泛素化和降解，NF2κB活化，可参与和免疫、血管生成、抗肿瘤、炎症反应有关的基因转录调控，并与细胞增殖有关。目前认为，NF2κB抑制细胞增殖作用主要与其抗凋亡、抗肿瘤和免疫激活功能有关[ 8]，同时与抑制新生血管也有关，通过抑制多种细胞NFκB的活化和一系列依赖NFκB细胞因子的分泌，这些细胞包括血管内皮细胞，血管平滑肌细胞，巨噬细胞[9-11]，而这些细胞均参与新生血管的形成。因此推测PDTC通过抑制NF2κB活性，抑制细胞增殖的作用。

　　我们以不同浓度PDTC干预人翼状胬肉成纤维细胞后MTT法显示，PDTC可抑制人翼状胬肉成纤维细胞生长,随着干预浓度的增大和时间延长，抑制率增加；我们还发现，PDTC干预人翼状胬肉成纤维细胞后, PCNA蛋白表达均下降，其下降程度与PDTC干预浓度均呈负相关。总之，本实验研究表明PDTC能时间、剂量依赖性的抑制HPF增生，提示PDTC对翼状胬肉的治疗具有潜在的应用前景，为翼状胬肉的药物治疗提供了一个新的思路。但目前研究仅限于离体实验，且PDTC发挥作用机制较为复杂，尚未系统、明确地了解，有待进一步研究。

　　【参考文献】

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