【Abstract】 AIM: To investigate dynamic expressions of RANTES and MCP1 in the epithelium of corneal limbus after limbal transplant and their relationship with rejections. METHODS:  Two groups of rats ［allograft group (AG group) and syngenicgraft group (SG group)］ underwent limbal transplantation and healthy rats were taken as normal controls. The expression of RANTES and MCP1 mRNA was detected by quantitative competitive RTPCR at postoperative days (POD) 1, 3, 7, 11, 14, 21 and 30 and rejections were observed. RESULTS:  Rejections appeared on POD5 and reached the peak on POD 8 to 10. The expression of RANTES and MCP1 mRNA after transplantation was greatly enhanced compared with that in the normal control group (P<0.05). RANTES reached peak on POD 7 and MCP1 on POD 11 and then descended constantly. The expression of RANTES and MCP1 mRNA was not different on POD 1 to 4 between AG group and SG group (P>0.05) but on POD 7 to POD 30 there were significant differences between the two groups (P<0.05). CONCLUSION:  Detection of the expression of RANTES and MCP1 mRNA may be helpful to the diagnosis of rejections and the prognosis.

　　【Keywords】 graft rejection; limbus corneae transplantation; chemokine; gene expression; polymerase chain reaction

　　【摘要】 目的： 研究RANTES和MCP1在大鼠角膜缘移植模型中的动态表达，探讨其与移植排斥反应发生的关系. 方法： 将大鼠随机分为同种异体移植组（AG组）、自体移植组（SG组），并以健康大鼠作为正常对照组（N组），用定量竞争性RTPCR的方法，在术后（POD）1, 4, 7, 11, 14, 21和30 d分别检测各组大鼠RANTES和MCP1 mRNA的含量，并观察大鼠眼表变化，判断排斥反应的发生. 结果： 术后5 d开始AG组出现排斥反应，8~10 d达到高峰. RANTES和MCP1 mRNA含量术后均大幅增加（P<0.05），RANTES于POD7达峰，MCP1于POD11达峰，随后均持续下降. POD1, 4 AG组与SG组RANTES与MCP1 mRNA含量无差异,POD7～30均有明显差异. 结论： 动态检测RANTES和MCP1 mRNA含量，可能有助于临床上对角膜缘移植排斥的诊断和对预后的估计.

　　【关键词】 移植物排斥；角膜缘移植；趋化因子；基因表达；聚合酶链反应

　　0引言

　　同种异体角膜缘移植术后排斥反应是导致手术失败的主要因素. 调节激活正常Ｔ细胞表达和分泌细胞因子（regulated on activation normal T expressed and secreted, RANTES），单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein1, MCP1）是CC（β）亚族趋化因子成员，能够通过趋化和激活单核巨噬细胞和淋巴细胞，参与调节机体的免疫应答［1］. 我们应用大鼠同种异体角膜缘移植模型，通过定量竞争性RTPCR检测移植术后不同时间角膜缘上皮中RANTES和MCP1 mRNA含量变化，探讨两者与移植排斥反应之间的关系.

　　1材料和方法

　　1.1材料选用体质量为200~250 g的雄性Wistar大鼠为供者，体质量为200~300 g的雄性SD大鼠为受者，均由北京大学实验动物中心提供. TRIzol Reagent购自Invitrogen公司，Oligo(dT) 15 Primer, MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶购自Promega公司， dNTP购自TaKaRa公司，EcoRⅠ购自Gibco公司，HindⅢ购自华美公司，9个PCR引物由北京赛百盛生物公司合成.
 
　　1.2方法

　　1.2.1分组实验随机分为两组，每组10只大鼠，均为右眼接受手术. ① 同种异体角膜缘移植组(Wistar→SD)；② SD大鼠间的移植作为自体移植对照组. 5只健康SD大鼠作为正常对照（双眼）.
 
　　1.2.2手术方法及术后观察① 以50 g/L戊巴比妥钠0.9 mL/kg腹腔注射麻醉Wistar或SD大鼠，常规无菌操作. ② 手术按照Dua［2］描述的方法，由角膜缘外0.5 mm开始剖分浅层巩膜组织直至角膜缘内0.5 mm的透明角膜处，得到环形角膜缘组织植片，将此植片移植于同样方法制作的植床上. 术毕结膜囊涂5 g/L红霉素眼膏，术后给予妥布霉素3次/d. ③ 观察角膜反应： 术后每日手术显微镜下观察植片、新生血管，并依据Mills等［3］提出的评分方法判断排斥反应的发生，直至术后30 d.
 
　　1.2.3取材和总RNA提取① 在术后（POD）1, 3, 7, 11, 14, 21和30 d ,分别刮取各组角膜缘植床上皮，放入EP管中；② TRIzol试剂一步法提取总RNA，测A值定量RNA浓度，加入3倍体积的无水乙醇，-70℃保存.

　　1.2.4定量竞争性RTPCR按照Bertolotto等［4］的方法进行. ① 引物设计. RANTESS引物： 5′ATCCCTCACCGTCATCCTC3′，A引物： 5′GCTCATCTCCAAATAGTTGATGT3′，T引物： 5′CGTCATCCTCCCTACCT CTCCCTCGCACT3′；MCP1（358 bp），S引物： 5′TAGCATCCACGTGCTG TCTC3′， A引物： 5′TGAGGTGGTTGTGGAAA AGA3′，T（270 bp）引物： 5′GTGCTGTCTCCGGCTGGAGAACTACAAGAGA3′；βactin（291 bp），S引物： 5′CTGGAGAA GAGCTATGAGCTG3′，A引物： 5′AATCTCCTTCTGCATCC TGTC3′，T（210 bp）： 5′GCCTTCCTTCCTGGGTATGGAATCCTGTGG3′.  ② RANTES和MCP1内标准的制备.  提取正常大鼠肝脏总RNA，经逆转录后分别用RANTESS, RANTESA引物PCR放大一段256 bp的RANTES cDNA. 用RANTEST及RANTESA然后用RANTESS及RANTESA作为引物，两次作PCR得到188 bp的DNA片段. 此即为RANTES mRNA RTPCR定量的竞争性内标准. 将这两个片段的DNA分别克隆至pBluescript(SK+)的EcoRV位点中, 质粒经扩增、纯化、HindⅢ酶切和紫外分光光度法定量后备用. 同样步骤得到MCP1正常（358 bp）和MCP1内标准（270 bp）的质粒. ③ RANTES和MCP1的定量. 取1 μg肝脏总RNA,逆转录成单链cDNA. PCR反应体系25 μL，含cDNA 3 μL,竞争性内标准质粒1 μL， 5 pmol/L RANTESS（或MCP1S）及RANTESA（或MCP1A）引物1 μL, 2.5 mmol/L dNTP 1 μL，含15 mmol/L MgCl2的10×PCR缓冲液2.5 μL，Taq DNA聚合酶20.84 nkat 0.25 μL. 反应条件： 95℃变性5 min，然后以94℃ 30 s, 61℃ 30 s, 72℃ 40 s热循环30次. 取6 μL PCR产物以15 g/L琼脂糖电泳分离和溴乙锭染色后, 用凝胶成像及定量扫描仪测得256 bp和188 bp两条带的光密度之比（或358 bp和270 bp两条带的光密度之比）. 参照文献［3］以系列稀释256 bp RANTES cDNA质粒（或358 bp MCP1 cDNA质粒）代替上述PCR体系中的cDNA，绘出标准曲线. 从标准曲线中求得mRNA的含量. 取2 μL PCR产物，以βactin引物作PCR，20个热循环后，PCR产物经琼脂糖电泳, 凝胶成像及定量扫描仪定量，求得标本中βactin的含量，以校正定量PCR时的加样误差.

　　统计学处理： 实验结果以x±s表示，采用SPSS 11.0进行重复测量方差分析. P<0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　同种异体角膜缘移植组： 手术5 d后开始可见排斥反应发生，8～10 d出现排斥高峰（6只），14 d排斥率达到最大值，总排斥率为9/10(90%)；自体角膜缘移植对照组： 术后虽然出现植片水肿、充血、轻度新生血管化，但无一例发生排斥反应.

　　2.1RANTES在各组表达量的动态变化正常对照组中每个时间点均有超过半数标本测不到RANTES的表达，平均RANTES表达量仅为（0.8~1.2）×10-12 mol/L. RANTES在异体移植组的表达较自体移植组明显升高（P<0.05），POD1和POD4 两组同时升高，自体移植组在POD4 RANTES表达量达到高峰；在POD7异体移植组RANTES表达量达到高峰，而自体移植组则开始下降；POD11后，两组中RANTES及MCP1表达均呈下降趋势（Fig 1）.

　　2.2MCP1在各组表达量的动态变化正常对照组中每个时间点均有超过半数标本测不到MCP1的表达，平均表达量仅为（1.1~2.5）×10-12 mol/L . MCP1在异体移植组的表达较自体移植组明显升高（P<0.05），POD1和POD4两组同时升高，自体移植组在POD4 RANTES表达量达到高峰；其后，异体移植组MCP1表达量持续上升，在POD11达到高峰，而自体移植组则开始下降；在POD14后，两组中RANTES及MCP1表达均呈下降趋势（Fig 2）.

　　3讨论

　　异体角膜缘移植是治疗多种严重眼表疾病，特别是治疗双眼眼表疾病的重要手段，移植免疫排斥是导致手术失败的主要原因. RANTES主要由活化的T淋巴细胞产生，它能和抗原信号共同刺激T淋巴细胞，促进T淋巴细胞的增殖，并能够特异性地趋化记忆T淋巴细胞和单核细胞. MCP 1主要由单核细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等产生，能够趋化和激活单核细胞［5］. RANTES和MCP1同属CC（β）亚族趋化因子成员，共同参与调节机体的免疫应答，在其他器官移植的研究中发现［6-8］，RANTES和MCP1等CC族趋化因子在趋化免疫细胞聚集至移植部位、造成移植物的损伤和导致移植免疫排斥中扮演着重要的作用.

　　我们在研究中发现，术后早期（14 d），同种异体角膜缘移植和自体角膜缘移植组RANTES和MCP1的表达均较正常状态下大幅度提高60~80倍，而两组之间并无明显差异. 说明手术早期的创伤性炎症应是造成RANTES和MCP1表达的直接因素，在临床上表现为局部组织的水肿和充血. 在术后7 d，随着手术本身造成创伤性炎症反应的减轻和针对异体移植物的免疫反应的持续，RANTES在自体移植组的表达量开始下降，而在异体移植组则到达高峰. 其后（8～10 d），临床观察发现异体移植组的局部炎症反应加重、植片充血水肿，累计超过2/3动物达到临床排斥标准，移植排斥出现高峰. 提示RANTES可能在术后早期趋化炎症细胞至移植物部位聚集、加重局部炎症反应、促进移植排斥反应发生中起着重要的作用. 术后11～30 d，自体移植组和异体移植组RANTES表达量均持续下降且两组间有明显差异. 自体移植组MCP1表达量的动态变化趋势与RANTES类似，术后7 d后开始持续下降；而异体移植组MCP1的表达量达峰时间较RANTES晚，在移植排斥高峰后的术后11 d出现，在此之后MCP1开始持续下降. 同RANTES一样，在术后7 d以后，两组中MCP1的表达量均有明显差异. MCP1达峰时间的“延后”提示，MCP1可能在移植术后组织损伤方面起着重要的作用.

　　对RANTES和MCP1表达量的动态检测，可能有助于临床上对角膜缘移植排斥的诊断和对预后的估计. 针对趋化因子的研究有助于更深刻地理解角膜缘移植排斥的发生机制，也可能为移植排斥的治疗提供新的靶点.

　　【参考文献】

　　［1］   Shallo H, Plackett TP, Heinrich SA. Monocyte chemoattractant protein1 (MCP1) and macrophage infiltration into the skin after burn injury in aged mice ［J］. Burns, 2003;29(7):641-647.

　　［2］    Dua HS. Allolimbal transplantation in patients with limbal stem cell deficiency ［J］. Br J Ophthalmol, 1999; 83(4): 414-419.

　　［3］    Mills RA, Coster DJ,  Williams KA . Effect of immunosuppression on outcome measures in a model of rat limbal transplantation ［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002; 43(3): 647-655.

　　［4］      Bertolotto A, Gilli F, Sala A, et al. Evaluation of bioavailability of three types of IFNbeta in multiple sclerosis patients by a new quantitativecompetitivePCR method for MxA quantification ［J］. J Immunol Methods, 2001;256(12):141-152.

　　［5］  Fokkema SJ, Loos BG, van der Velden U. Monocytederived RANTES is intrinsically elevated in periodontal disease while MCP1 levels are related to inflammation and are inversely correlated with IL12 levels ［J］. Clin Exp Immunol, 2003;131(3):477-483.

　　［6］    Moench C, Uhrig, A, Lohse AW, et al. The role of monocyte chemoattractant protein1 in orthotopic liver transplantation ［J］. Transplant Proc, 2003; 35(4):1452-1455.

　　［7］    Colvin BL, AW Thomson. Chemokines, their receptors, and transplant outcome ［J］. Transplantation, 2002; 74(2): 149-155.

　　［8］    King WJ,  Corner RM,  Hudde T, et al. Cytokine and chemokine expression kinetics after corneal transplantation ［J］. Transplantation, 2000; 70(8): 1225-1233.