糖尿病视网膜病变患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的变化及相关研究

　　中华眼科杂志 1998年第6期第0卷 眼底病

　　作者：何剑峰　仇宜解　周行涛

　　单位：266003 青岛医学院附属医院眼科［何剑峰(研究生，现在广西柳州市人民医院眼科)］

　　关键词：糖尿病视网膜病；红细胞膜；腺苷三磷酸酶；红细胞变形性

　　【摘要】　目的　探讨糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的变化及其意义。方法　应用孔雀绿比色分析法对40例DR患者、20例糖尿病无视网膜病变患者及20例正常人的红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性进行检测，并将其结果与红细胞内Na+、K+浓度、红细胞变形指数(erythrocyte deformability index，EDI)、空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)、糖基化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)及病程等进行相关分析。结果　糖尿病患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降，DR患者下降更为显著；Na+-K+-ATP酶活性下降与红细胞内Na+、K+浓度、EDI、FBG、HbA1c的变化及病程长短密切相关。结论　红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性改变对红细胞变形能力有影响，红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的异常下降可能参与DR病变的发生、发展过程。

　　A study of Na+-K+-ATP ase activity in erythrocyte membrane from diabetic retinopathy patients　　He Jianfeng, Qiu Yijie, Zhou Xingtao. Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College. Qingdao 266003

　　【Abstract】　Objective　To study the changes of Na+-K+-ATPase activity in erythrocyte membrane and its significance.Methods　Na+-K+-ATPase activity in erythrocyte membrane was investigated with malachite green colorimetric analysis in 40 patients with diabetic retinopathy (DR), 20 diabetic patients with non DR (NDR), and 20 sex and age metched normal control subjects. The relations of Na+-K+-ATPase activity with content of Na+ and K+ erythrocyte deformability index (EDI), levels of fasting blood glucose (FBG), glycosylated hemoglobin (HbA1c), and the course of disease were also studied.Results　Na+-K+-ATPase activity in erythrocyte membrane was significantly decreased in diabetic patients (P＜0.01). The decrease was most significantly in patients with DR (P＜0.01). The decreased Na+-K+-ATPase activity was related to the content of Na+ and K+ in erythrocyte, the changes of EDI, FBG, HbA1c, and the course of disease (P＜0.01).Conclusions　The decreased Na+-K+-ATPase activity in erythrocyte membrane affects the deformability of erythrocyte. It may contribute to the occurrence and development of DR.

　　【Keywords】　Diabetic retinopathy　　Erythrocyte membrane　　Adenosine triphosphatase　　Erythrocyte deformability

　　糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病晚期的常见并发症，其发生机制尚未完全阐明。红细胞膜结构和功能的异常是糖尿病慢性并发症发生、发展的重要因素，红细胞膜Na+-K+-ATP酶在糖尿病晚期并发症中的作用已引起人们的重视［1，2］。我们对40例DR患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、红细胞内Na+和K+浓度、红细胞变形指数(erythrocyte deformability index，EDI)、空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)、糖基化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)等进行测定及分析，并将其结果与糖尿病无视网膜病变患者及正常人进行对比分析，旨在探讨DR发生、发展的有关因素。

　　资料与方法

　　一、对象

　　1.患者组：非胰岛素依赖型糖尿病患者60例。其中男、女各30例；年龄21～68岁，平均52.0±9.6岁；病程4个月至21年，平均11.4±7.8年；患者均按1985年WHO制定的标准由我院内分泌科确诊［3］。根据眼底检查和眼底荧光素血管造影(fundus fluorescein angiography，FFA)结果分组：(1)糖尿病无视网膜病变(non-DR，NDR)组20例；(2)背景型糖尿病视网膜病变(background diabetic retinopathy，BDR)组20例；(3)增殖型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)组20例。DR诊断分期按1985年全国眼底病学组制定的标准［4］。

　　2.正常对照组：20例，其中男、女各10例；年龄20～67岁，平均51.0～9.2岁，全身及眼部检查均无器质性心血管、肝、肾、血液、代谢及眼部疾病。

　　二、检测方法

　　1.红细胞膜Na+-K+-ATP酶测定：(1)红细胞溶血液制备：取新鲜肝素抗凝血1.5 ml，分离红细胞，4℃条件下以10倍生理盐水洗涤3次，吸0.1 ml洗后红细胞，置入含Tris-HCl(20 mmol/L，pH 7.6)缓冲液试管中，加入1%皂素(Saponin)10 ml，室温下放置15分钟溶血，以2 500 r/min离心5分钟，上层液即为溶血液。采用高铁氰化法测定溶血液血红蛋白浓度。(2)酶促反应：取A、B两管，二管最终反应混合液均为0.5 ml。反应液成分：A管MgCl2 3.6 mmol/L，乙二胺四乙酸0.5 mmol/L，哇巴因(G-strophanthin)0.9 mmol/L，Na2ATP 2.5 mmol/L(反应前加入)；B管中除不加哇巴因外，其余成分同A管。分别加入溶血液10 μl，于37℃水浴2小时，每种标本均做双份。(3)无机磷(Pi)测定：在以上各管中加入孔雀绿(malachite green)-钼酸铵(ammoniam molybdate)-曲拉通(triton)X-100混合液(浓度分别为1.5 mmol/L，40 mmol/L和5% v/v)，1分钟后加入1.5 mmol/L柠檬酸，20分钟后于751型分光光度计上以650 nm波长进行比色。(4)酶活力表示法：以每克血红蛋白溶血液与底物在37℃水溶液中温育2小时，以水解ATP酶释放出的无机磷量表示，酶活力单位：(μmol Pi*g Hb)/2 h。

　　3.红细胞内Na+、K+浓度测定：取肝素抗凝血1.5 ml，离心、弃血浆和白细胞，洗涤红细胞3次，取0.2 ml置于含邻苯二甲酸二丁酯0.2 ml的离心管中，15 000 r/min离心10分钟弃上层分离液，取底层压紧红细胞50 μl，用A6241型稀释器低渗锂溶血(3 mmol/L)稀释200倍，溶血后用FLM3火焰光度计(丹麦产)测定Na+、K+浓度。每份血均测双份。

　　3.红细胞变形性测定：采用XG-1型核孔滤膜红细胞变形测定仪测定，以红细胞滤过指数(erythrocyte filterability index，EFI)表示红细胞变形能力。EFI值愈大，红细胞变形能力愈差。

　　4.空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)测定用葡萄糖氧化法；糖基化血红蛋白(glycosylated, Hemoglobin，HbA1c)测定采用微柱法。

　　三、统计分析方法

　　数据以±s表示，统计方法用方差分析、两两比较和直线相关分析。

　　结果

　　一、正常对照组与DR各组间各指标检测结果

　　DR各组红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞内K+浓度均明显降低(P＜0.01)，而红细胞内Na+浓度、EFI、FBG、HbA1c则显著增高(P＜0.01)，这些改变均随DR病情的加重而更趋明显。其与NDR和正常对照组比较差异均有显著性(附表)。

　　二、各指标间的相关性检验

　　糖尿病患者各指标经直线相关分析显示：红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性与FBG、HbA1c、EFI、红细胞内Na+浓度及糖尿病病程均呈高度负相关，相关系数r值分别为-0.7684，-0.7539，-0.7867，-0.7598，-0.6921，均P＜0.01；而与细胞内K+浓度呈正相关，r=0.7453，P＜0.001。EFI与FBG、HbA1c、红细胞内Na+浓度及糖尿病病程呈正相关，r值分别为0.7424，0.8247，0.8413，0.7038；均为P＜0.001。

　　附表　正常对照组与糖尿病视网膜病变各组间各指标检测结果比较(±s)

　　*对照组与DR各组间比较　**NDR组与BDR组比较　△BDR组与PDR组比较

讨论

　　一、Na+-K+-ATP酶在维持红细胞体积中的作用

　　红细胞膜Na+-K+-ATP酶是一种镶嵌在红细胞膜脂类双层脂质中的蛋白质，具有水解ATP酶活性，从分解ATP中获得能量，同时逆浓度差主动地将细胞外液中的K+移入细胞内，将细胞内的Na+移出膜外，以维持细胞内、外的离子梯度，从而控制细胞体积。细胞体积是影响红细胞变形能力的重要因素之一。我们的观察结果表明：DR患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性明显下降，红细胞内Na+浓度增加。经相关分析显示，EFI与前两者有密切联系。因此，我们认为红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降是导致细胞内钠水潴留、细胞体积增大及变形能力下降的重要因素之一。

　　二、影响DR患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的因素

　　本文研究结果显示：DR患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性显著下降，同时伴有FBG及HbA1c的显著增高，且糖尿病病程越长，红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降越显著，DR的程度也越重。直线相关分析表明：DR患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性与FBG、HbA1c及糖尿病病程密切相关，提示糖代谢紊乱控制不良是导致DR患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降的重要因素。这可能与糖代谢障碍致红细胞膜糖酵解供能障碍、ATP生存减少有关。

　　三、Na+-K+-ATP酶活性下降与DR的关系

　　一些研究表明，糖尿病患者神经、心脏、血管内皮等组织细胞膜Na+-K+-ATP酶活性均有改变［5］。我们的研究结果表明：DR患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性明显下降，红细胞内Na+显著增加，EFI明显增高。这些改变在PDR患者中更为显著。Na+-K+-ATP酶的主要功能之一是排出细胞内钠离子，而从细胞外液中将K+移入细胞内，从而维持细胞内、外的离子梯度，控制细胞体积。Na+-K+-ATP酶活性下降势必引起红细胞内钠、水潴留，细胞体积增大、变形能力下降，从而导致血液流变学的异常。现已证实，红细胞变形能力和血液流变学的异常在DR等糖尿病慢性并发症的发生、发展中起一定作用［6］。由此可见，Na+-K+-ATP酶活性下降通过影响红细胞的变形能力而对DR的发生、发展起作用。本文研究结果显示：随着糖尿病病程的延长，红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降更为显著，同时DR的程度也加重。但DR患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降的确切机制尚待进一步研究。

　　参考文献

　　1　Kowlutu R, Suhail M, Dominigue RJ, et al. Reversible sodium pump defect and swelling in the diabetic rat erythrocyte: effects on filterability and implications or microangiopathy. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86：3327-3338.

　　2　Hirata Y, Greene DA, Gabby kH, et al. Relation of Na+-K+-ATPase to delayed motor nerve condition velocity: effect of aldose reductase inhibitor. Metabolism, 1990,39：563-582.

　　3　WHO Study Group on Diabetes Mellitus. Technical reports series 729. Geneva: World Health organization, 1985.11-16.

　　4　中华医学会眼科学会眼底病学组.糖尿病视网膜病变分期标准.中华眼科杂志，1985，21：113.

　　5　Greene DA, Thomas AB, Masson EA, et al. Are disturbance of sorbitol, phosoinositides and Na+-K+-ATPase regulation involved in pathogenesis of diabetic neuropathy? Diabetes, 1988,37：688-693.

　　6　杜振亚，谭家铨，黄傅倪.糖尿病性视网膜病变与血液流变学(综述).国外医学眼科学分册，1994，18：166-167.