经上丘逆行标记法视网膜神经节细胞定量的实验研究
眼科研究 2000年第3期第18卷 实验研究
作者：朱益华 蒋幼芹 刘忠浩 罗学港 吴振中
单位：朱益华（博士研究生，现在福建医科大学第一附属医院眼科）；蒋幼芹 吴振中 （410011 长沙，湖南医科大学第二附属医院眼科）；刘忠浩 罗学港（湖南医科大学神经生物学研究室）
关键词：视网膜神经节细胞；上丘；辣根过氧化物酶
摘要 目的 建立一种视网膜神经节细胞(RGCs)定性及定量的研究方法，并了解大鼠RGCs密度分布情况。方法 暴露大鼠双上丘后将饱含30%辣根过氧化物酶(HRP)溶液的明胶海绵片贴附于双上丘表面，大鼠存活24h后，取出视网膜行HRP组织化学反应，计算机图像分析系统对RGCs进行分类及计数。结果 左右眼RGCs密度分别为1466±376／mm2及1457±404／mm2，左眼鼻、颞侧RGCs密度分别为1490±371／mm2及1442±382／mm2，右眼鼻、颞侧RGCs密度分别为1467±410／mm2及1446±400／mm2。结论 成功地建立了直接上丘HRP逆行标记RGCs定量计数法，正常大鼠双眼RGCs密度基本相同，颞侧及鼻侧RGCs密度基本相同。
分类号 R774
An experimental study on quantitative retrograde labeling of retinal ganglion cells of normal rats via superior colliculus
Zhu Yihua，Jiang Youqin，Liu Zhonghao
（Department of Ophthalmology，Second Affiliated Hospital，Hunan Medical University，Changsha 410011）
Abstract Objective To establish a quantitative method that might help to reveal the distribution of retinal ganglion cell（RGC）density in the rat．Methods A skin incision is made along the sagittal suture to expose the skull and bilateral with 0.5cm×5cm holes was made in parietal bone using a dental drill．The dura mater is partially removed covering the superior colliculus（SC） removed by electric suction．By this process，bilateral SC were totally exposed．A small piece of gelfoam sheet fully sucked on the surface of two SCs．After 24h，the retina was peeled off and HRP histochemistry reaction was performed．Counting and classification of RGCs were made by computerized image analyzer．Results Mean±SD of the RGCs density from the left eye and from the right eye was 1466±376／mm2 and 1457±404／mm2 respectively．Mean±SD of the RGCs density from nasal and temporal retina in left eye was 1490±371／mm2 and 1442±382／mm2，whereas that of in right eye was 1467±410／mm2and 1446±400／mm2．Different parts of retina have different RGCs density，mean±SD of the RGCs density in the right eye were 1720±395／mm2（center）， 1438±336／mm2（middle） and 1212±269／mm2（periphery），whereas that of in left eye were 1680±366／mm2（center），1466±330／mm2（middle）and 1253±304／mm2（periphery）．The constituent ratio of large，middle and small RGCs in normal rats were 22％，25％ and 53％， respectively．Conclusion Quantitative retragrade labeling by axoplasmic transport of RGCs of normal rat via SC was established successfully．The RGC density didn’t vary from bilateral eyes and from temporal and nasal retina in normal rats has no significant difference，but in the center，middle and peripheral part of the retina RGCs density were different significantly．Small RGCs occupy the major percentage in the retinal ganglion cells layer．
Key words retinal ganglion cells superior colliculus horse radish peroxidase
视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)是青光眼病理性损伤的主要靶细胞。许多致病因素可引起视神经轴浆运输障碍，最终导致RGCs死亡。近些年来，在体及离体RGCs的研究已成为青光眼及神眼科学研究的热点。可是，使用常规视网膜切片、全层辅片及染色的方法很难区分位于RGCs层中的RGCs与其它细胞，如移位于RGCs层中的无长突细胞，这种细胞大量存在于大鼠RGCs层中［1］。我们很难根据它们的形状与大小来确定是RGCs；此外损伤后的RGCs表型改变，易影响RGCs计数结果。然而，用逆行标记法作RGCs定量研究解决了这一问题。我们参照国外一些学者的研究方法［2～3］，采用辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)经上丘逆行标记法对15只正常大鼠RGCs进行标记，并对其数量分布等进行分析。
1 材料与方法
1．1 实验动物 湖南医科大学附二院动物室提供的Sprague-Dawley健康雄性大鼠15只(30眼)，体重200～250g，裂隙灯下检查角膜透明，双瞳孔等大等圆。
1．2 HRP标记上丘 腹腔注射3%戊巴比妥钠，1ml／kg麻醉大鼠。立体定位仪固定鼠头部于俯卧位，剪除头顶部毛发，矢状缝处皮肤作长约1.5cm之切口，暴露出颅骨，用牙钻在两侧顶骨上制成约0.5cm×0.5cm之骨孔，骨孔距顶枕缝约1～2mm，尽量避免损伤脑膜静脉窦。用显微镊撕开骨孔处之硬脑膜，电动吸引器吸出覆盖于上丘表面的脑组织，暴露双侧上丘，用针灸针在双上丘各部表面刺孔20个。取大小约5mm×5mm×2mm之明胶海绵2块，浸泡在30%HRP液中1min后取出迅速贴附于双上丘表面，缝合皮肤。
1．3 固定视网膜 HRP明胶海绵贴附上丘24h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠，1.5ml／kg深度麻醉大鼠。打开胸腔暴露心脏及升主动脉，在主动脉弓下方用止血钳夹住降主动脉，12号针头从左心室穿刺进入升主动脉，同时剪开右心房，从与穿刺针头相连的橡皮管处灌注温生理盐水约300ml，5min左右灌完，然后再灌10%常温中性福尔马林约200ml，先快后慢，约30min灌完。
1．4 视网膜HRP组织化学反应 摘除眼球后在手术显微镜下小心剥取视网膜，将视网膜放入10%中性福尔马林中后固定约20min，后将视网膜放入0.1mol／LPBS中漂洗两次。再将视网膜放入0.5%二氨基联苯胺液(DAB)中预孵育20min之后在20mlDAB液中加入0.01%双氧水0.5ml，镜下控制反应时间，0.1mol／LPBS漂洗视网膜两次，终止反应。将视网膜平铺在1%明胶玻片上，置4℃冰箱过夜，酒精梯度脱水，二甲苯透明2次，中性树脂及盖玻片封片。
1．5 计算机细胞图像分析 在每张待测视网膜盖玻片上通过视乳头对称划线，并将每一象限视网膜分为3等份，即中央、中间及周边，采用MIAS－300图像分析系统，512×512象素，255个灰度级，将显微镜下定好位的视网膜片按划区顺序在显微镜下用高速电视摄像机扫描，图像显示于监视器，在视网膜每象限的分区内，随机取3个点，每个点的面积为8200μm2，数每个点的细胞数，3个点的细胞均数定为该区的细胞数，然后换算成每平方毫米的细胞数。根据细胞大小将RGCs分成3个类型，即大、中、小RGCs，切面积＞250μm2的节细胞称为大节细胞，切面积为150～250μm2为中节细胞，切面积＜150μm2为小节细胞。
1．6 所有数据资料均采用WINDOWS环境下SPSS统计软件包处理，统计学方法为t检验及F检验。
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