2　结果

　　2．1　左眼RGCs密度的均数及标准差为1466±376／mm2，右眼为1457±404／mm2，两眼RGCs密度差异无显著性(P＞0.05)。

　　2．2　左眼视网膜颞侧RGCs密度的均数及标准差为1442±382／mm2，鼻侧为1490±371／mm2，颞侧与鼻侧比较差异无显著性(P＞0.05)。

　　2．3　右眼视网膜颞侧RGCs密度的均数及标准差为1446±400／mm2，鼻侧为1467±410／mm2，颞侧与鼻侧比较差异无显著性(P＞0.05)。

　　2．4　右眼中央区RGCs密度的均数及标准差为1720±395／mm2，中间区为1438±366／mm2，周边区为1212±269／mm2，3组间两两比较差异均有显著性(P＜0.05)。

　　2．5　左眼视网膜中央区RGCs密度的均数及标准差为1680±366／mm2，中间区为1466±330／mm2，周边区为1253±304／mm2，3组间两两比较差异均有显著性(P＜0.05)。

　　2．6　大、中、小神经节细胞占两眼被标记的RGCs数的构成比分别为22%，25%及53%，其中以小RGCs所占比例较大，节细胞形态以多突触型多见。
 
　　3　讨论

　　直接经大鼠上丘逆行标记RGCs定量计数法，国内文献尚未见报道。其主要原因可能是活体上解剖定位上丘较困难，且术中出血、脑脊液漏出等影响手术操作。大脑皮质吸出过多易致大鼠死亡，过少则上丘暴露不满意。肉眼下见上丘体积甚小，较难与脑其它组织区分，抽吸大脑皮质时易将上丘一并抽出。本研究在放大6倍的手术显微镜下操作，经反复多次实验，成功地建立了经上丘逆行标记的RGCs定量计数方法。这一方法的建立，无疑为视神经轴浆运输及RGCs的研究提供帮助。

　　3．1　经上丘标记物种类

　　RGCs是视网膜细胞中惟一将其轴突伸入中枢神经系统的细胞，因此，将标记物植入轴突的投射部位，如上丘或外侧膝状体，则可特异性地逆行标记RGCs。RGCs的标记物种类很多，例如HRP［3］，荧光素金［2］，若丹明-β-异硫氰酸盐(rhodamine-β-isothiocyanate，RITC)，脂溶性花青染料(dioctadyl，Dil)等。但不管使用何种标记物，其标记的方法基本相同，包括立体定位注射法，直视下注射法及包埋法，粘有标记物的明胶海绵贴附法等。立体定位注射需较精密的立体定向仪，且每一实验动物均需作病理切片以证实注射部位的准确性。最近的资料多采用直视下上丘注射或明胶海绵贴附法［2］。本研究采用手术显微镜下经上丘HRP明胶海绵贴附法，即将饱含30%HRP的明胶海绵片贴附于上丘表面。其优点是：(1)上丘定位直观准确；(2)HRP缓慢持续地释放被上丘内细胞所吸收；(3)视网膜各象限RGCs标记满意。但是，相对于立体定位注射及视神经内直接注射标记物等方法难度较大。标记细胞计数常采用两种方法，即计算机细胞图像分析技术及网格显微镜下计数法。

　　3．2　RGCs的密度及分类

　　3．2．1　RGCs的密度　由于使用动物种类、标记物及控制的条件不同，所以报告出不同的结果，有些结果之间相差较为悬殊。祝枚东等［4］及徐新荣等［5］用HRP直接注入视神经的方法所得兔RGCs平均密度及标准差分别为1040±121.2／mm2(n＝6)和1154±9.45／mm2(n＝10)，而柴戬臣等［7］用同样方法仅得到每眼平均480个被标记的RGCs。Sells-Navarro等［2］应用荧光金经上丘得到标记的大鼠RGCs密度为2421±55／mm2(n＝20)，而Vidal-Sanz等［6］应用Dil经大鼠上丘及外侧膝状体后标记的RGCs平均密度为2288±66／mm2(n＝4)。我们的研究结果为：正常大鼠左眼RGCs密度为1466±376／mm2，右眼RGCs密度为1457±404／mm2，双眼RGCs密度比较差异无显著性(P＞0.05)。从上述报道结果看出，由于标记物种类及使用方法不同，即使采用同一种实验动物，标记的RGCs密度也有较大差异，所以对RGCs正常值的确定还有待进一步统一实验的条件。

　　3．2．2　RGCs的分类　RGCs依据其胞体及轴突的大小，生理功能的不同分成不同的类型。目前较多地采用W，X，Y细胞分类法［8］，W细胞胞体和轴突直径最小，X细胞胞体和轴突直径较W细胞稍大，接近RGCs的平均值，Y细胞胞体和轴突直径最大。我们根据细胞的切面积将RGCs分成大、中、小3种，3种RGCs所占比例分别为22%，25%及53%，小RGCs占多数。我们认为，按切面积大小测定出3种RGCs，即大、中、小细胞，它们与Y，X，W细胞可能有一定的对应关系。

　　3．3　不同区域RGCs分布情况　为了解RGCs不同区域密度的分布情况，我们将同一眼球鼻、颞侧及中央、中间、周边部RGCs密度进行了对比分析。结果显示鼻、颞侧RGCs密度比较差异无显著性(P＞0.05)，而中央、中间、周边部RGCs密度经方差分析显示，3组中两两比较的差异均有显著性(P＜0.05)，越近中央区，RGCs的密度越高，越近周边区则RGCs密度越低，这种分布特征与Wassle等［9］的研究结果相一致。

　　3．4　影响RGCs密度的因素　年龄影响RGCs密度的研究报道较多。Balazsi等［10］研究显示随着年龄增长，视神经纤维逐渐减少，因而间接地反映了随着年龄的增加，RGCs的密度会逐渐减低。此外，动物种类不同，RGCs标记方法的不同亦会影响其密度，即使是同一种标记方法，也受诸多因素的干扰。HRP逆行标记法作为一种组织化学方法，受反应时的温度、酸碱度及反应时间等因素影响，所以，在实验中一定要注意保持实验条件一致性。anglion cell layer of the rat retina．Neuroscience，1981，6∶931

　　2，Selles-Navarro I，Villegas-Perez MP，Salvador-Silva M，et al．Retinal ganglion cell death after different transient periods of pressure-induced ischemia and survival intervals．Invest Ophthalmol Vis Sci，1996，37∶2002

　　3，Sautter J，Sabel BA．Recovery of brightness discrimination in adult rats despite progressive loss of retrogradely labelled retinal ganglion cells after controlled optic nerve crush．Eur J Neurosci，1993，5∶680

　　4，祝枚东，蔡丰英．复方丹参注射液对慢性高眼压兔眼视神经轴浆流影响的研究．中华眼科杂志，1991，27(3)∶174

　　5，徐新荣，蔡丰英．葛根素对慢性高眼压兔视神经轴浆流影响的实验研究．中国中医眼科杂志，1997，7(1)∶3

　　6，Vidal-sanz M，Villegas-Perez MP，Bray GM，et al． Persistent retrograde labelling of adult rat retinal ganglion cells with the carbocyanine dye dil．Exp Neurol，1988，102∶92

　　7，柴戬臣，袁桂琴，魏宝林，等．急性高眼压对兔视神经轴浆运输的影响——实验性青光眼．眼科研究，1984，2(4)∶202

　　8，Sanchez RM，Dunkelberger GR，Quigley HA．The number and diameter distribution of axons in the monkey optic nerve．Invest Ophthalmol Vis Sci，1986，27∶1342

　　9，Wassle H，Grunert U，Rohrenbeck J，et al．Cortical magnification factor and the ganglion cell density of the primate retina．Nature，1989，341∶643

　　10，Balazsi AG，Rootman J，Drance SM．The effect of age on the nerve fiber population of the human optic nerve．Am J Ophthal，1984，97∶760

　　(收稿：1999－10－20　修回：2000－02－15)

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