【摘要】 目的：观察氩离子激光视网膜光凝后糖尿病大鼠眼玻璃体及视网膜组织内色素上皮衍生因子（pigment epitheliumderived factor, PEDF）蛋白质表达的变化。
方法：选用先天性糖尿病GK大鼠20只，对所有大鼠左眼施行氩离子激光视网膜光凝，右眼不进行光凝，作为自体对照。激光光凝后3d处死动物，取出眼球， Western Blot和免疫组织化学染色检测玻璃体和视网膜组织中PEDF蛋白质表达的变化。
结果：氩离子激光视网膜光凝后糖尿病大鼠玻璃体和视网膜中PEDF蛋白的表达均明显升高（P<0.01）；且PEDF蛋白主要存在于RPE细胞层、光感受器细胞层、外核层和神经节细胞层，内核层表达的强度低于上述4层。
结论：氩离子激光光凝可以上调糖尿病大鼠玻璃体和视网膜组织PEDF表达，抑制新生血管形成，达到治疗的目的。
【关键词】 糖尿病视网膜病变 色素上皮衍生因子 激光凝固术 western blot 免疫组化
0引言
增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy, PDR）是当今世界上最主要的致盲性眼病之一。其中视网膜和脉络膜新生血管是造成PDR患者视力下降的主要原因。新近的研究表明，视网膜新生血管的形成与眼内促血管生成和抑制血管生成的细胞因子分泌的失衡有直接关系[1]。色素上皮衍生因子（pigment epitheliumderived factor, PEDF）是目前所知的最有效的新生血管抑制剂。PEDF通过诱导新生血管内皮细胞发生凋亡从而抑制新生血管的形成[2]。同时，PEDF通过与其受体结合，启动NFкB等信号转导途径启动一些具有神经营养作用的靶基因的转录从而保护光感受器细胞和神经节细胞以及其他非视网膜起源的神经细胞[3]。此外，在PDR中PEDF还可以通过其抗氧化特性减轻糖基化终产物对周细胞的损害，起到保护作用，从而发挥双重的治疗作用[4]。视网膜激光光凝是目前临床上治疗PDR的主要手段。激光光凝术能否通过影响细胞因子的表达来发挥治疗作用成为我们所关注的问题。我们通过Western blot和免疫组化的方法，检测氩离子激光光凝前后糖尿病大鼠视网膜中PEDF表达量的变化，为今后PDR的综合治疗提供新的思路。
1材料和方法
1.1材料
雄性先天性糖尿病GK大鼠20只， 20wk龄，购买自中国科学院上海市实验动物中心。随机编号，记录为1～20。将所有大鼠左眼定为试验组施行氩离子激光光凝，激光参数：0.1ms，150mW，100μm，100点/眼；右眼为自身对照，不施行任何光凝。激光光凝后3d，处死动物，取出眼球，分离眼前节及内容物，Western blot法测定玻璃体中PEDF蛋白含量，剩余眼杯组织进行免疫组化研究。
1.2方法
1.2.1 Western blot测定蛋白含量
将玻璃体组织匀浆后制成蛋白质提取液，采用考马斯亮兰G250（Coomassie Brilliant Blue G250, CBBG250）染色法进行蛋白质定量，经120g/L SDS－PAGE电泳分离蛋白，考马斯亮兰G250染色确定蛋白位置，根据凝胶面积选择电流1mA/cm2，电转移2h，将SDSPAGE凝胶中蛋白转移至PVDF滤膜，丽春红S染色确定转移成功，特异性抗体与靶蛋白结合后，ECL指示剂显色。
1.2.2免疫组化
将100g/L多聚甲醛溶液固定好的眼杯组织，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，石蜡包埋，做5μm厚度连续切片，经脱蜡，梯度酒精水化，10mL/L H2O2甲醇溶液（V/V∶H2O2∶甲醇=1∶99）室温孵育15min，切片置切片架上，浸没于0.01mol/L柠檬酸缓冲液（CBS，pH6.0）中，煮沸15min；PBS（pH7.4）溶液浸洗3次后，正常山羊血清封闭，稀释的一抗（山羊抗鼠PEDF多克隆抗体，1∶100稀释）孵育，置冰箱内4℃过夜；PBS（pH7.4）溶液浸洗3次，加入HRP偶联的二抗（兔抗山羊IgG，1∶200稀释）置37℃，60min；PBS（pH7.4）溶液浸洗3次，DAB显色，苏木素复染；逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。记录视网膜各层组织PEDF表达强度，按下述标准进行评价：0级：染色深度与背景颜色相同；1级：染色较浅；2级：染色中等深浅；3级：染色较深。所有切片评价由笔者和两位没有眼科相关知识的不知情者独立进行，三者评价之均数作为该切片强度等级。
统计学处理：所有数据以Excel软件表格存储，应用SPSS12.0统计软件对激光光凝前后样本均数进行配对t检验。P<0.05作为差别具有统计学意义。
2结果
2.1 Western Blot结果分析
玻璃体组织中提取的蛋白质，经120g/L SDSPAGE电泳，可见50kDa处有清晰蛋白条带(图1)，经Western blot检验，于感光底片上相应部位见阳性条带，证明该条带即为PEDF蛋白质（图2）。图像分析软件测得底片PEDF条带与内参照条带处A值，其比值作为PEDF蛋白质相对含量，激光前PEDF蛋白相对含量为0.401±0.067，激光后PEDF相对含量为0.550±0.065，经配对t检验，t=14.257，P<0.01，统计学分析显示激光光凝后糖尿病大鼠玻璃体组织中的PEDF蛋白质表达较光凝前增加，差别有显著统计学意义。
2.2激光前、后PEDF表达
对激光光凝前后糖尿病大鼠视网膜组织免疫组化切片染色深度进行比较（图3AF），激光前(图3A、C、E)视网膜组织PEDF染色深度为1.17±0.56，激光后（图3B、D、F）视网膜组织PEDF染色深度为2.08±0.62，经配对t检验，t=6.90，P<0.01，显示激光光凝前后糖尿病大鼠视网膜组织PEDF表达强于激光前，差别有显著统计学意义。说明激光可以上调糖尿病大鼠视网膜组织中PEDF蛋白质表达。光学显微镜下观察免疫组织化学染色切片，见视网膜神经节细胞层、内核层、外核层、光感受器细胞层及RPE细胞层均有PEDF蛋白阳性表达，其中神经节细胞层、外核层、光感受器细胞层和RPE细胞层表达呈强阳性，内核层呈弱阳性表达，且于激光后大鼠视网膜见广泛RPE细胞脱离,内核层见较多空泡及空隙。
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