【摘要】目的：研究基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对大鼠角膜碱性烧伤后角膜新生血管的抑制作用。方法：取健康成年Wistar大鼠20只，随机分成实验组和对照组，每组10只。两组均建立大鼠角膜碱性烧伤模型。实验组滴用GM6001滴眼液、氧氟沙星滴眼液和硫酸软骨素滴眼液；对照组滴用氧氟沙星滴眼液和硫酸软骨素滴眼液；各种滴眼液每日点眼4次，共7d。裂隙灯下观察角膜溃疡和角膜新生血管生长情况。结果：碱烧伤后实验组和对照组出现新生血管的时间无显著差异（P>0.05）。新生血管的生长长度与生长面积，在伤后1d和3d，实验组和对照组无显著差异（P>0.05）；在伤后5d和7d，实验组和对照组有显著差异（P<0.05）。结论：基质金属蛋白酶抑制剂GM6001点眼对角膜新生血管的生长有抑制作用。
【关键词】 基质金属蛋白酶抑制GM6001；角膜；新生血管
Restrained effect of GM6001 the tissue inhibitor of matrix metalloproteinases on the growth of rats corneal neovascularization after alkaline burn
QingCheng Shi, JianHua Ning
Shenyang Aier Hospital of Ophthalmology and Optometry, Shenyang 110003, Liaoning Province, China
Correspondence to:QingCheng Shi. Shenyang Aier Hospital of Ophthalmology and Optometry, Shenyang 110003, Liaoning Province, China. [email protected]
Abstract AIM: To study the restrained effect of GM6001 the tissue inhibitor of matrix metalloproteinases (TIMP) on the growth of rats corneal neovascularization after alkalineburn.
METHODS: Twenty Wistar rats were randomly divided into 2 groups, experimental group and control group, 10 rats in each group. In two groups, central corneas of rat eyes were burned by 1mol/L NaOH for 120 seconds. GM6001 eyedrops, Ofloxacin eyedrops and chondroitin sulfate eyedrops were used in experimental group. Ofloxacin eyedrops and chondroitin sulfate eyedrops were used in control group. Eyedrops were applied four times a day for one week in each group. The occurrence and development of CNV were observed by slitlamp microscope everyday. The length and the area of CNV were calculated.
RESULTS: The occurrence of CNV in experimental group was (1.40±0.05)d , and was (1.25±0.10)d in control, with no significant difference in the occurrence time of CNV（P>0.05）, in the length（P>0.05）and area of CNV at first day and third day after being burned. Significant difference（P<0.05）was found at fifth day and seventh day after being burned.CONCLUSION: GM6001 restrains the progress of corneal ulcer and the growth of corneal neovascularization.
KEYWORDS: GM6001 the tissue inhibitor of matrix metalloproteinases; cornea; neovascularization
0引言
基质金属蛋白酶（MMP）是一组与角膜基质溶解密切相关的蛋白酶，GM6001是一种新型的人工合成的MMP抑制剂，对MMPS的抑制力远远强于其他常规药物如乙酰半胱氨酸、枸橼酸钠等。我们应用GM6001治疗大鼠角膜碱烧伤，探讨GM6001对碱烧伤后角膜溶解及角膜新生血管抑制作用的疗效。
1材料和方法
1.1材料
健康成年Wistar大鼠20只，无任何眼疾，体质量0.20～0.25kg，雌雄各半，购自佳木斯医学院。MMP抑制剂GM6001粉剂，二共药公司，日本东京，20g/L DMSO粉剂(二甲亚砜)，HEPES溶液(N2羟乙基哌嗪N′2乙磺酸)，佳木斯医学院药理实验室提供。裂隙灯显微镜，透射电子显微镜，佳木斯医学院提供。将GM6001粉剂置于含20g/L DMSO粉剂的HEPES缓冲溶液中，制成质量浓度为400mg/L的GM6001滴眼液（pH7.4），置于4℃冰箱中备用[1]。
1.2方法
将大鼠置于乙醚罐中1min后，称体质量，采用氯丙嗪12.5mg/kg，ip麻醉，固定大鼠，2.5g/L地卡因溶液点眼局部麻醉，将浸泡有1mol/L氢氧化钠溶液的直径为3.0mm圆形单层滤纸片，置于大鼠角膜中央2min，取下，用生理盐水冲洗结膜囊1min。将20只大鼠随机分成2组，每组10只，分别为实验组和对照组。实验组术后点氧氟沙星滴眼液和硫酸软骨素滴眼液及400mg/L的GM6001滴眼液；对照组术后点氧氟沙星滴眼液和硫酸软骨素滴眼液；每种滴眼液每日早、中、晚及夜间点眼4次，每种滴眼液时间间隔为20min。大鼠均于碱性烧伤后开始每日行裂隙灯显微镜下检查，分别记录于碱性烧伤后的1，3，5，7d角膜缺损面积，缺损深度以及角膜新生血管的生长情况。
1.2.1角膜新生血管定量分析
裂隙灯显微镜下检查，分别记录于碱性烧伤后的1，3，5，7d各组大鼠角膜新生血管长度和数量。测量时，以连续弯曲小、角膜新生血管朝向角膜混浊中心生长的最长血管为准，并计算角膜新生血管的生长面积A＝C/12×3.1416[r2(rl)2][2]，C为角膜新生血管累及角膜的圆周钟点数，l为角膜新生血管从角膜缘深入角膜的长度，r（大鼠角膜半径）＝3.5mm[3]。
1.2.2电子显微镜检查
取带有1mm宽巩膜的角膜组织用于透射电子显微镜的观察，标本切成1mm×6mm组织条块，置于20g/L戊二醛溶液固定2h后泡入二甲砷酸钠缓冲溶液中浸洗1d，然后以10g/L锇酸1h，再用二甲砷酸钠缓冲溶液冲洗，丙酮梯度脱水，环氧树脂618定向包埋，切片机超薄切片，电镜下观察大鼠角膜碱性烧伤后，再生上皮的厚薄、细胞排列极向及细胞间距。细胞间桥粒结构及细胞器（包括线粒体、粗面内质网和游离的核糖体、微管、微丝等）的改变。
统计学处理：数据使用SPSS10.0软件进行统计学检验并判断结果。
2结果
2.1角膜新生血管(CNV)
大鼠角膜碱性烧伤后,裂隙灯显微镜下观察,实验组角膜新生血管出现的时间为 1.40±0.05d,迟于对照组1.25±0.10d,两者差异无显著意义(P>0.05)。角膜碱性烧伤后1，3，5，7d,两组角膜新生血管区的面积及最长角膜新生血管长度分别进行方差分析,发现伤后1d和3d两者差异无显著性（P>0.05）；在伤后5d和7d，两者有显著性差异（P<0.05，表1）。表1大鼠眼碱性烧伤后CNV生长长度和面积（略）
2.2角膜形态学
角膜碱性烧伤后，即可见角膜中央区出现一个与滤纸片直径相同的、边界清楚的灰白色混浊区。裂隙灯下观察发现，伤后1d和3d，实验组和对照组角膜溃疡及新生血管生长情况基本平行；伤后5d，两组角膜损伤面积及损伤深度均有所增加，但对照组程度比实验组严重很多，角膜表面布满了新生血管，有一眼发生前房积脓，两眼发生角膜穿孔。伤后7d，实验组和对照组损伤面积减小，角膜溃疡有所修复。实验组角膜新生血管(CNV)细小,稀疏,管径细,多集中于上角膜缘和下角膜缘,无一例生长达烧伤区。对照组角膜新生血管粗乱,密集成堆,不易分辨,所有新生血管均长入角膜碱性烧伤区,有5例达到角膜碱性烧伤斑的对侧（图1）。
2.3透射电镜检查结果
实验组碱性烧伤后7d，角膜上皮缺损，再生上皮厚薄不均匀，一些区域细胞极向排列不清，细胞间距宽，形成宽窄不一的裂隙，细胞间桥粒结构明显减少，一些区域消失。线粒体、粗面内质网和游离的核糖体增加，也能见到成束排列的微丝。底层细胞形态不规则，其下基底膜连续性中断，半桥粒结构不明显，一些区域见上皮下有不规则裂隙（图2A1,A2）。对照组碱性烧伤后7d，除了出现与实验组相同的改变外，还可见在角膜的基质内，可见新生血管形成，形态多样，许多新生毛细血管被基质中新生的胶原纤维所围绕，毛细血管壁增厚，腔内可见红细胞。基质内胶原原纤维有明显改变：胶原原纤维粗细不等，排列紊乱，间隙大小不均，可见红细胞。新生血管内含有许多炎性白细胞，角膜的实质内亦有大量的炎性白细胞的浸润（图2B1,B2）。
3讨论
角膜内无血管是维持角膜透明和角膜免疫赦免（immune privilage）的必要条件。在一些病理情况下如缺氧、炎症、感染及外伤等均可诱发角膜新生血管而破坏角膜的完整性并造成不良后果。研究表明，新生血管的形成是多因素参与的结果，这些因素包括炎症介质、细胞因子、生长因子和MMP等[4]，其中血管内皮细胞、角膜上皮和内皮细胞产生的MMPS对新生血管的发芽及血管内皮细胞在角膜实质内的移动有着重要作用[5]。
碱性烧伤后角膜溃疡的形成极大程度上是蛋白水解酶作用的结果。在诸多的蛋白水解酶中，最主要的是MMP。MMP是在结构上，具有极大同源性的一组锌离子依赖的内肽酶家族[6,7]。MMP在角膜组织中是以无活性的酶原形式存在，受蛋白分解作用的刺激而激活，其活性可被MMP抑制剂所抑制[2]。目前所知的能抑制MMP表达的物质不多。GM6001使一种新合成的MMP抑制剂[8],它的分子结构为｛N2(R)2(hydroxamidocarbonylmethl)4methlpentanoyl〕Ltryptophane methylamide｝。Masferrer等[9]用不同浓度的GM6001滴眼液对严重碱性烧伤兔角膜进行治疗，也取得了与本研究类似的良好疗效。
碱性烧伤后角膜新生血管增殖分3个阶段[10]：1）潜伏期：伤后24h内角膜缘血管网扩张，通透性增强，血管内炎性细胞聚集、黏附、渗出、趋化至烧灼区；2）血管形成期：碱性烧伤后27h角膜缘血管网有血管芽生长，3d后长入角膜，此期新生血管生长速度最快；3）血管退行期：烧伤后7d，新生血管延伸停滞，许多已形成的新生毛细血管被吸收，血管密度下降。故我们选择碱性烧伤后1，3，5，7d观察大鼠角膜溃疡及角膜新生毛细血管（CNV）的生长情况。我们通过建立大鼠角膜碱性烧伤模型明确了碱性烧伤后基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对角膜溃疡的发生及角膜新生血管的发生有明显的抑制作用，为临床合理地应用GM6001提供了实验依据。
【参考文献】
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8 Fini ME, Girard MT, Matsubara M, et al. Unique regulation of the matrixmetalloproteinase, gelatinase B. Invest Ophthalmol Vis Sci1995;36(3):622633
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10 Ronk JF, RuizEsmenjaud S, Osorio M, et al. Limbal conjunctival autograft in a subacute alkaline corneal burn. Cornea1994;13(5):465468 |
