【摘要】目的：探讨洛伐他汀（lovastatin）对大鼠角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和转化生长因子β1（transforming growth factorbeta1，TGFβ1）表达的影响。
方法：建立碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管的动物模型，治疗组和对照组分别给予105mol/L洛伐他汀溶液和生理盐水点眼，采用裂隙灯观察新生血管的生长情况，用免疫组织化学方法检测VEGF及TGFβ1的表达，并在基因水平下采用RTPCR方法检测大鼠角膜VEGF mRNA的表达水平。
结果：各时间点角膜新生血管的面积，治疗组均低于对照组，差异有显著性（P<0.05），免疫组化染色显示，治疗组VEGF及TGFβ1的表达量较对照组明显减少，在造模后4d角膜组织中VEGF mRNA的相对表达量，治疗组低于对照组（0.422±0.083 vs 0.786±0.126, P<0.05）。
结论：洛伐他汀通过下调VEGF及TGFβ1的表达，抑制血管内皮细胞增殖，最终可有效抑制碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管形成。
【关键词】 洛伐他汀；大鼠角膜新生血管；血管内皮生长因子；转化生长因子β1
Effect of lovastatin on the expression of VEGF and TGFβ1 of corneal neovascularization of rats
YanNi Jiang, MingChang Zhang
Department of Ophthalmology, Union Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Abstract
AIM: To investigate the effect of lovastatin on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and transforming growth factorbeta1 (TGFβ1) in corneal neovascularization (CNV) of rats.
METHODS: Corneal neovascularization model was established by alkaline burning. CNV model rats were randomly divided into two groups: the experimental group received 105mol/L lovastatin drops, and the control group was treated with physiologic saline. The growth of neovascularization was observed under slit lamp microscopy. The expression of VEGF and TGFβ1 in CNV of each rat were detected by immunohistochemical staining. And the VEGF mRNA expression in rat’s cornea was measured by RTPCR.
RESULTS: Compared with the control group, the growth of CNV in experimental group at various time points was reduced significantly (P<0.05). Immunohistochemistry showed that the expression of VEGF and TGFβ1 in experimental group was lower than that in control group. At 4 days of injury, the expression of VEGF mRNA in the cornea of experimental rats was decreased compared to with that of control rats (0.422±0.083 vs 0.786±0.126, P<0.05).
CONCLUSION: Lovastatin can effectively inhibit the growth of CNV induced by alkaline burning through reducing the expression of VEGF and TGFβ1 in cornea.
KEYWORDS: lovastatin; corneal neovascularization; vascular endothelial growth factor; transforming growth factorbeta1
0引言
角膜新生血管化是很多眼科疾患致盲的重要原因[1]。由于缺乏特效的治疗手段，目前对于抑制角膜新生血管化有大量的研究。洛伐他汀（lovastatin）是一种HMG CoA还原酶抑制剂。在很多抗肿瘤实验中可以抑制肿瘤新生血管的形成。我们研究洛伐他汀对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和转化生长因子β1（transforming growth factorbeta1，TGFβ1）表达的影响以及对大鼠角膜新生血管的治疗作用。
表1大鼠角膜新生血管面积（略）
1材料和方法
1.1材料 健康Wistar大鼠30只，体质量180～200g，不分雌雄，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。随机分为A治疗组和B对照组。每组15只30眼。100g/L水合氯醛3mg/kg，ip麻醉，2.5g/L地卡因滴眼液表面麻醉；将直径为3mm的圆形滤纸片，浸泡于1mol/L NaOH溶液中1min后，贴于大鼠角膜中心表面25s，移去滤纸片，立即用大量生理盐水冲洗。洛伐他汀、二甲基亚砜（DMSO，Amresco）、RTPCR试剂盒及PCR反应试剂购自武汉凌飞科技有限公司；免疫组化试剂及方法由同济医学院免疫教研组提供。
1.2方法 洛伐他汀治疗组给予105mol/L洛伐他汀滴眼，每日4次；对照组给予生理盐水滴眼，每日4次。所有碱烧伤模型的动物每日给予阿托品眼膏涂眼1次。用裂隙灯显微镜于1，4，7，14，21d测量大鼠角膜新生血管并照相，测量从角巩缘向心性生长的新生血管长度，每张图片在不同象限测量5个值，取其平均值得出不同组不同时期角膜新生血管的长度，计算角膜新生血管面积。公式S=C/12×3.1416×[r2(rl)2]，C为新生血管累及角膜的圆周钟点数，l为新生血管从角膜缘伸入角膜的长度，r为角膜半径。将两组大鼠在1，4，7，14，21d处死，取下大鼠角膜，一半角膜用40g/L多聚甲醛溶液4℃下固定，包埋后做免疫组织化学染色，另一半角膜立即做逆转录聚合酶链反应（RTPCR）分析。
1.2.1 VEGF和TGFβ1表达的检测 采用SABC法进行免疫组化检测，并在光学显微镜下观察，照相。比较治疗组与对照组的VEGF及TGFβ1的表达情况。
1.2.2 VEGF mRNA表达的检测 参照trizol试剂说明书提取总RNA，紫外分光光度仪检测浓度和纯度，取总RNA 2μg，用逆转录试剂盒进行逆转录，PCR扩增VEGF及内参照βactin。VEGF的PCR引物（正义链：5’CGA CAG AAG GGG AGC AGA AAG3’，反义链：5’GCA CTC CAG GGC TTC ATC ATT3’）[2]，扩增产物为194bp；βactin引物（正义链：5’GAG CTA TGA GCT GCC TGA CG3’，反义链：5’AGC ACT TGC GGT CCA CGA TG3’）[2]，扩增产物为406bp。用GIS凝胶成像系统进行拍摄，软件分析，检测碱烧伤后4d VEGF及其内参βactin的吸光度值，计算4d的VEGF表达相对值。
统计学处理：各组数据均用 ±s表示，使用SPSS11.5统计软件采用单向方差分析t检验，P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1角膜新生血管的生长情况 实验组大鼠在角膜碱烧伤后CNV的生长较对照组稀疏，生长明显受抑制（图1）。烧伤后1，4，7，14，21d t值分别为4.754，5.658，4.703，5.760，4.979，差异均有显著意义（P<0.05，表1)。
2.2 VEGF和TGFβ1的表达 棕黄色为VEGF表达阳性。碱烧伤后4d，对照组大鼠角巩膜缘处炎性细胞侵润明显，上皮层及基质层内大片棕黄色颗粒，基质层见密集的新生血管管腔，血管内皮染色强阳性（图2A），7d见扩大的血管管腔，上皮层仍见VEGF染色阳性，炎细胞胞浆中见棕黄色颗粒（图2B），14d后角膜炎性反应减轻，基质层染色区变少，21d见血管已部分退化，VEGF表达水平明显下降。治疗组大鼠在碱烧伤后4d，角膜基质层内CNV较少，排列稀疏，角膜上皮基底膜和新生血管内皮见VEGF染色阳性，角巩膜缘处炎性细胞较对照组少（图2C），7d角膜CNV生长减慢，密度降低，基质层炎性反应明显减轻（图2D），14d部分血管开始退化，细胞胞浆中VEGF染色变淡，21d角膜基质层内见少数闭塞的CNV，仅见少量细胞胞质内染成浅棕黄色。棕色为TGFβ1表达阳性。在正常组织中，TGFβ1仅在角膜上皮基底膜表达，我们可以见到在4d对照组的角膜上皮全层染成棕色，此外角膜基质中炎症细胞及血管内皮细胞胞质中也出现了棕色染色颗粒（图3A），而在4d治疗组的角膜上皮、基质层及血管内皮细胞染色明显较对照组淡（图3B）。
图1大鼠角膜碱烧伤后7d CNV生长（略）
A：对照组 B：治疗组
2.3 VEGF mRNA的表达 电泳中内参条带亮度一致，两组VEGF mRNA的条带亮度在4d均为最高，7d次之，1d和14d的电泳条带亮度最低（图4）。治疗组和对照组在碱烧伤后4d VEGF mRNA的相对表达量分别为0.422±0.083，0.786±0.126，t值为5.887（P<0.05），治疗组较对照组低，差异有显著性，与电泳结果中观察到的VEGF mRNA条带亮度一致。
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