作者：熊思齐,夏晓波
作者单位：中国湖南省长沙市，中南大学湘雅医院眼科
【摘要】 目的：研究促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）的特异性小干扰RNA(siRNA) 对EPO表达的抑制作用,为视网膜新生血管的治疗提供新的途径。
方法：体外培养NIH/3T3细胞,分成正常氧状态培养组和低氧培养组。通过脂质体(LF2000) 将EPO siRNA 转染两组细胞。采用RTPCR及Western blot技术观察正常氧及低氧环境下EPO siRNA对细胞内EPO表达的抑制效果。
结果：正常氧及缺氧环境下，EPO siRNA能明显抑制NIH/3T3细胞内EPO mRNA及蛋白质的表达。
结论：EPO siRNA 能显著抑制EPO的表达, 为视网膜新生血管的基因治疗提供了新途径。
【关键词】 促红细胞生成素；小干扰RNA ；NIH/3T3细胞；新生血管
Inhibition of erythropoietin expression by small interfering RNA under normoxia and hypoxia condition
SiQi Xiong, XiaoBo Xia
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No.030471853)
Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
AbstractAIM: To investigate the inhibitory effect of small interfering RNA (siRNA) targeting erythropoietin on the expression of erythropoietin in cultured cells, and to explore a new approach to genetherapy for retinal revascularization.
METHODS: NIH/3T3 cells were cultured in vitro and divided into normoxia and hypoxia group. After transfected erythropoietin siRNA into NIH/3T3 cells by Lipofectamine 2000, erythropoietin expression was examined by using RTPCR and Western blot.
RESULTS: Erythropoietin mRNA and protein expression in cultured NIH/3T3 cells under both normoxia and hypoxia condition was downregulated significantly.
CONCLUSION: siRNA against erythropoietin effectively inhibits the expression of erythropoietin and provides a new approach to gene therapy for retinal neovascularization.
KEYWORDS: erythropoietin; small interference RNA; NIH/3T3 cell; neovascularization
Xiong SQ, Xia XB. Inhibition of erythropoietin expression by small interfering RNA under normoxia and hypoxia condition. Int J
0引言
视网膜新生血管性疾病是目前主要的致盲性眼病, 血管内皮生长因子(VEGF)被公认为是最重要的促视网膜新生血管形成因子[1]。目前针对VEGF进行的分子治疗，如VEGF单克隆抗体等都只能部分的抑制视网膜新生血管的发生[2]。其原因可能是还有其他促血管生成因子在视网膜新生血管形成中起着重要的调控作用。最近的研究表明促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是一种强效的血管内皮细胞有丝分裂源。EPO通过其促血管内皮细胞增殖、迁移作用参与了视网膜新生血管的形成[3]。本研究研究EPO特异性的小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)在正常氧及低氧条件下对NIH/3T3细胞内EPO表达的抑制，从而为靶向EPO的siRNA 抑制视网膜新生血管的发生提供理论基础。
1材料和方法
1.1材料 NIH/3T3细胞（购自中南大学湘雅医学院细胞中心）；Trizol裂解液及微量总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；反转录及cDNA 合成试剂盒(美国Fermentas Life Science公司)；兔抗鼠EPO抗体（美国Santa Cruz公司）。
1.2方法
1.2.1靶位的选择及siRNA的设计 根据人类基因库(NCBI, GENE BANK)中人EPO基因(NM_007942)的mRNA序列合成靶向EPO的siRNA(由广州市锐博生物公司合成)。EPO siRNA序列如下:正义链(53)AAAAGAAUGGAGGUGGAAGAAdTdT. 反义链(35):dTdTUUUUCUUACCUCCACCUUCUU.非特异性的阴性对照siRNA也由广州锐博生物公司设计合成。
1.2.2细胞培养 将NIH/3T3细胞分为正常氧培养组和低氧培养组。正常氧组在37℃、50mL/L CO2饱和湿度的孵育箱中培养,培养液为含100mL/L进口胎牛血清的DMEM高糖培养基,隔天换液1次,每4～5d用2.5g/L胰蛋白酶消化传代培养。低氧组通过给NIH/3T3细胞换以含终浓度为100μmol/ L氯化钴的DMEM培养液进行化学模拟缺氧培养。
1.2.3细胞转染 转染前将1×106 NIH/3T3细胞接种于6孔板，孔板中培养至细胞融合度达90%左右。在微量离心管中准备溶液A、B。A液:250μL DMEM培养液+10μL LipofectamineTM2000室温放置;B液:250μL DMEM培养液+0.2nmol EPO siRNA或阴性对照siRNA室温放置。将A, B两液混合后室温放置20min。用DHanks液洗涤细胞2次，于6孔板中加入1.5mL不含血清的DMEM培养液，将A和B混合液加入6孔板中轻轻摇晃使之均匀与细胞接触（孔板中EPO siRNAA或阴性对照siRNA的最终转染浓度为100nmol/L），37℃培养6h，弃去培养液，换不含抗生素的完全培养液培养。
1.2.4 RTPCR检测EPO mRNA表达水平 （1）细胞总RNA提取：根据Trizol总RNA提取说明书提取细胞总RNA。（2）逆转录反应：cDNA第一链的合成按照RevertAidTM cDNA第一链合成试剂盒说明书进行。产物放入20℃备用。（3）聚合酶链反应：EPO引物序列：上游 5 TGGAGGTGGAAGAACAGG3下游 5GCAGTGAAGTGAGG CTACG3 βactin引物序：上游：5 CTGGGACGACATGGAGA AGA 3下游：5 AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC 3反应条件：94℃预变性5min，然后94℃30s, 55℃40s, 72℃45s，共29个循环，最后72 ℃延伸lOmin。取5μL PCR产物于15g/L琼脂糖凝胶上进行电泳,同时以DNA marker为分子量标准。结果以EPO与内参照βactin mRNA扩增产物的灰度相对比值表示。
1.2.5 Westren blot检测EPO蛋白表达水平 细胞加入蛋白抽提液裂解，离心提取细胞蛋白后测定蛋白质浓度。于SDSPAGE胶电泳后电转移至硝酸纤维膜，加入一抗（兔抗鼠EPO单克隆抗体）4℃孵育12h后，加二抗（生物素化的羊抗兔IgG）室温孵育1h，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素室温孵育30min,ECL化学发光法检测。以βactin作为内对照。
统计学处理：采用SPSS 11.0统计软件包对数据进行单因素方差分析。多组间比较采用ANOVA 方差分析,转染组与空白对照组间比较采用Dunnettt检验,以P<0.05作为差异有统计学意义。
[1] [2] 下一页 |
