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2结果
2.1正常氧及低氧环境下EPO siRNA对细胞内EPO mRNA表达的抑制 通过RTPCR技术检测正常氧及低氧环境下EPO siRNA对细胞内EPO mRNA表达的抑制效果。如图1示：EPO mRNA扩增产物大小为165bp，βactin扩增产物大小564bp。正常氧及低氧环境下，EPO siRNA转染组细胞内EPO mRNA的表达水平较空白对照组明显下调，两者间差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照siRNA转染组与空白对照组EPO mRNA表达水平差异无统计学意义。
2.2正常氧及低氧环境下EPO siRNA对细胞EPO蛋白表达的抑制 采用western blot技术检测正常氧及低氧环境下EPO siRNA对NIH/3T3细胞EPO蛋白质表达的抑制效果。如图2示：34kDa处检测到EPO蛋白表达，42kDa处检测到βactin蛋白表达。与RTPCR检测结果相对应，正常氧及低氧环境下，EPO siRNA转染组细胞内EPO 蛋白表达水平较空白对照组明显下调，两者间差异有统计
图1RTPCR检测正常氧及低氧环境下EPO siRNA对细胞内EPO mRNA表达的抑制 将EPOsiRNA转染NIH/3T3细胞后，采用RTPCR技术检测细胞内EPOmRNA的表达。正常氧及低氧环境下,EPO siRNA能明显抑制NIH/3T3细胞内EPOmRNA的表达
图2 Western blot检测正常氧及低氧环境下EPOsiRNA对细胞内EPO蛋白表达的抑制 将EPOsiRNA转染NIH/3T3细胞后，采用Western blot技术检测NIH/3T3细胞EPO蛋白的表达。正常氧及低氧环境下，EPO siRNA能明显抑制NIH/3T3细胞内EPO蛋白的表达水平
学意义(P<0.05)。阴性对照siRNA转染组与空白对照组EPO 蛋白表达水平差异无统计学意义。
3讨论
促红细胞生成素（EPO）为红细胞生成的刺激剂，它通过促进红细胞系统前体的增殖和分化、增加抗凋亡蛋白的表达及抑制凋亡过程来维持红细胞生成与耗损的动态平衡[4]。最近的研究发现EPO还具有促进新生血管形成的能力。体外培养的视网膜微血管内皮细胞中加入外源性的EPO，血管内皮细胞的增生与迁移能力明显增强，其诱导血管内皮细胞增生与迁移的能力与血管内皮细胞生长因子（VEGF）相当[2]。在肿瘤新生血管形成过程中，肿瘤组织局部缺氧能上调组织中EPO的表达水平，EPO通过其促内皮增生、迁移作用参与诱导肿瘤新生血管的发生。而抑制EPO的表达能明显减少肿瘤新生血管的发生，达到抑制肿瘤生长的目的[5]。那么在眼部新生血管发生过程中，EPO起着怎样的作用？在增殖性糖尿病视网膜病变发生过程中，玻璃液中的EPO表达水平明显升高。这些由缺血、缺氧的视网膜细胞合成并分泌的EPO通过其促新生血管形成作用来加速增殖性糖尿病视网膜病变的发生。由此可见EPO在视网膜新生血管发生过程中起着重要的调控作用。
RNA 干扰指与内源性mRNA 编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞时,该序列mRNA发生特异性的降解,并导致基因表达的沉默。因为在抑制基因表达方面具有特异性强、高效性、副作用小等优点, RNA干扰已被广泛应用于基因功能研究及基因治疗领域。其可能的机制为:外源性或内源性siRNA与Dicer酶结合形成RISC复合体(RNA induced silencing complex)。siRNA 反义链识别与其有序列同源的靶mRNA ,并引导RISC复合体与mRNA 结合,核酸酶Dicer将mRNA切割成小片段,从而特异地抑制靶基因的表达[6]。
RNA干扰实验中，由于细胞瞬时转染效率不高，常对检测siRNA的抑制效率带来较大的影响。因此，本研究选用转染效率相对较高的NIH/3T3细胞进行研究。我们的研究结果表明：正常氧环境下，通过脂质体包裹进入NIH/3T3细胞内的EPO siRNA能高效的抑制EPO基因在转录及蛋白水平上的表达。但增生性糖尿病视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞、早产儿视网膜病变，随着疾病的进展都会出现视网膜组织的缺氧，缺氧的视网膜组织合成并释放包括EPO在内的多种促血管生成物质，从而促进视网膜新生血管的形成[2,7]。因此，我们需要进一步确定EPO siRNA在缺氧环境是否也能高效的抑制细胞内EPO的表达。结果表明：缺氧环境下，进入细胞内的siRNA能象在正常氧环境下一样顺利地与Dicer酶结合形成RISC复合体，进而引导RISC复合体与EPO mRNA 结合,从而特异并高效地抑制细胞内EPO的表达。我们推测：EPO siRNA同样能在视网膜血管阻塞性疾病缺氧的视网膜细胞中引起针对EPO的RNA干扰效应，下调病理情况下异常升高的EPO。
综上所述，本研究选取的EPO特异性siRNA能在正常氧及缺氧的环境下高效抑制细胞内EPO的表达。因此，本研究为后续抑制视网膜新生血管的活体实验提供了理论依据。
【参考文献】
1 Peer J, Shweiki D, Itin A, et al. Hypoxiainduced expression of vascular endothelial growth factor by retinal cells is a common factor in neovascularizing ocular diseases. Lab Invest1995;72:638 645
2 Shen J, Samul R, Silva RL, et al. Suppression of ocular neovascularization with siRNA targeting VEGF receptor 1. Gene Ther2006;13:225234
3 Watanabe D, Suzuma K, Matsui S, et al. Erythropoietin as a retinal angiogenic factor in proliferative diabetic retinopathy. N Engl J Med 2005;353:782792
4 Silva M,Grillot D,Benito A, et al.Erythropoietin can promote erythroid progenitor survival by repressing apoptosis through BclXL and Bcl2. Blood1996; 88: 15761582
5 Hardee ME, Cao Y, Fu P, et al. Erythropoietin blockade inhibits the induction of tumor angiogenesis and progression. PLoS ONE2007;20;2:e549
6 Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21 and 22nucleotide RNAs. Genes Dev2001;15:188200
7 Wang YJ, Liu S. Study advance on the protective effect of erythropoietin on retin. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi)2007;7(1):162164 上一页 [1] [2] |
