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2结果
2.1免疫组化染色结果 免疫组化MMP1、MMP3均主要表达于视网膜组织的视锥视杆层、外网状层、内网状层、神经纤维层。MMP1、MMP3在A组微弱表达，呈淡黄色颗粒状。在B组1d显著表达，随着病程的延长，MMP3呈进行性减弱；MMP1在B组3d开始表达，7d表达最强，随着病程的延长，MMP1呈进行性减弱。在C各个亚组均微弱表达。TIMP1在A组中等表达，在B与C各个亚组均有明显表达（图1AF）。
2.2免疫组化计算机图像分析结果
2.2.1 MMP1的测定 外伤后1,21,28d，B组与A组、C组与B组MMP1表达的平均灰度值的比较差异均无显著性。外伤后3,7,14d，B组MMP1表达的平均灰度值明显低于A组（均P<0.01）；C组MMP1表达的平均灰度值明显高于B组（均P<0.01），但与A组比较差异无显著性。B组，3d MMP1表达的平均灰度值下降，7d达到低谷，之后随着病程的延长，MMP1表达的平均灰度值逐渐升高（图2A）。
2.2.2 MMP3的测定 外伤后1,3,7d，B组MMP3表达的平均灰度值明显低于A组（P<0.01）；C组MMP3表达的平均灰度值明显高于B组（P<0.01），但与A组比较差异无显著性。外伤后14,21,28d，B组与A组、C组与B组MMP3表达的平均灰度值的比较差异均无显著性。B组，随着病程的延长，MMP3表达的平均灰度值呈增高趋势（图2B）。
2.2.3 TIMP1的测定 外伤后各个亚组，B组、C组TIMP1表达的平均灰度值明显均低于A组（P<0.01）；且B组与C组比较差异无显著性（图2C）。
2.2.4 MMP1/TIMP1的测定 对MMP1/TIMP1平均灰度值比值进行单因素方差分析结果见表1。若MMP1/TIMP1平均灰度值比值降低，则表明MMP1/TIMP1比率增高，反之则MMP1/TIMP1比率降低。外伤后1,21,28d，B组和C组MMP1/TIMP1的平均灰度值比值明显高于A组（均P<0.01）；但B组和C组之间的比较差异无显著性。外伤后3,7,14d，B组MMP1/TIMP1的平均灰度值比值明显低于A组（均P<0.05）；C组MMP1/TIMP1的平均灰度值比值明显高于B组和A组（均P<0.01）；外伤后3,7,14d，B组MMP1/TIMP1比率增高（表1）。
2.2.5 MMP3/TIMP1的测定 对MMP3/TIMP1平均灰度值比值进行单因素方差分析结果(表2)。若MMP3／TIMP1平均灰度值比值降低，则表明MMP3/TIMP1比率增高，反之则MMP3/TIMP1比率降低。外伤后1,3,7d，B组和C组MMP3/TIMP1的平均灰度值比值明显低于A组（均P<0.05）；C组MMP3/TIMP1的平均灰度值比值明显高于B组和A组（均P<0.01）；外伤后14,21,28d，B组MMP3/TIMP1的平均灰度值比值明显高于A组（均P<0.01）；C组MMP3/TIMP1的平均灰度值比值明显高于A组（均P<0.01），但与B组的比较差异无显著性。外伤后1,3,7d，B组MMP3／TIMP1比率增高（表2）。
3讨论
PVR是在孔源性视网膜脱离或视网膜复位手术后及眼穿通伤后严重的并发症，常导致视力障碍及至失明。在这病理过程中MMPs与TIMPs系统起着重要作用。MMPs是一类活性依赖于Ca2+Zn2+离子的蛋白水解酶，以无活 表1MMP1/TIMP1平均灰度值比 bP<0.01外伤后应用GM6001组(C) 、外伤性PVR组(B) vs正常对照组（A）；dP<0.01 外伤后应用GM6001组(C) vs外伤性PVR组(B)表2MMP3/TIMP1 平均灰度值比性酶原形式合成分泌，在多种因子的作用下激活成有活性的MMPs，活化的MMPs可降解多种ECM成分[1,2]，破坏基底膜屏障，促进细胞的移动，还可激活其它MMPs的前体。本研究中MMP1是胶原酶亚家族中的主要成员之一，能特异性降解基质中的间质胶原(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 型胶原)，同时亦作用于Ⅶ,Ⅸ型胶原、明胶、蛋白多糖和层粘连蛋白等而破坏基质的正常结构和生理功能。MMP3是基质降解酶亚家族中的一种，MMP3在ECM的降解中起着关键性作用，能够降解包括蛋白多糖、层粘蛋白、纤维连接蛋白、明胶和Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅹ型胶原。MMP3可通过激活其它潜在的MMPs，故为基质降解的主要酶类。TIMPs是MMPs的特异性抑制剂，与MMPs按1∶1比例结合形成复合物而抑制其活性。二者的表达平衡参与细胞外基质(ECM)的破坏和重塑，影响PVR的形成。现已发现的TIMPs共有四种，分别是TIMP1,TIMP2,TIMP3和TIMP 4。Webster等[3]在视网膜下膜和视网膜前膜的实验研究中发现TIMP1在PVR的增殖膜中均有表达,说明TIMP1在孔源性视网膜脱离后异常愈合过程中发挥作用。GM6001又名Galardon或ilomastat，是已知作用最强的合成的基质金属蛋白酶抑制剂，是一种前景极好的合成抑制剂，现在已被应用于临床研究阶段。Prinomastat(AG3340)是在应用药物晶体结构设计技术中发现的一种具有选择性的小分子量(423d)MMPs抑制剂，它可以与MMPs的活性位点结合，从而选择性抑制MMP2,MMP9,MT1MMP、胶原酶和MMP3。
本研究结果显示视网膜组织MMP1,MMP3和TIMP1表达显著增强提示ECM与基底膜的降解及合成代谢均异常活跃。MMP1,MMP3使得Ⅶ型胶原、层粘连蛋白和ECM中的Ⅰ,Ⅴ,Ⅶ型胶原等的降解明显增强，导致细胞赖以增殖、生存的基底膜和ECM组分发生改变，导致PVR生成；TIMP1是MMP1,MMP3的特异性抑制剂，使ECM的降解减少，沉积增加，从而对后期瘢痕和新生血管的减少起作用。因此MMP1,MMP3,TIMP1极有可能共同参与了视网膜ECM与基底膜成分转换的多种生理、病理过程[4]。我们发现外伤后PVR的早期视网膜组织的MMP3，MMP1表达增强，而TIMP1的拮抗作用不能对应增高，MMP3，MMP1与TIMP1比例的失衡，使得Ⅶ型胶原、层粘连蛋白和ECM中的Ⅰ，Ⅴ，Ⅶ型胶原等的降解明显增强，导致细胞赖以增殖，生存的基底膜和ECM组份发生改变,导致PVR生成；晚期MMP1，MMP3表达逐渐下降，TIMP1仍明显表达，抑制MMP1，MMP3的活性[5]，从而减轻基底膜和ECM的降解以及细胞浸润，从而影响PVR的进程。我们还发现外伤后应用GM6001组，TIMP1处于相对平稳的高表达，MMP1和MMP3的表达均与正常视网膜组织的表达相近。以上结果表明GM6001可能通过降低视网膜组织MMP1和MMP3的活性，减轻对ECM的降解和破坏作用，对MMP1/TIMP1和MMP3/TIMP1的失衡可能起一定的调节作用，从而维持视网膜基底膜与ECM基质降解与沉积的平衡。这为人工合成治疗外伤性PVR提供了新的理论依据。
【参考文献】
1 Nagase H, Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases. J Biol Chem1999;30:2149121494
2 Kenney MC, Chwa M, Alba A, et al. Localization of TIMP1, TIMP2, TIMP3, gelatinase A and gelatinase B in pathological human corneas. Curr Eye Res1998;17:238246
3 Webster L, Chignell AH, Limb GA. Predominance of MMP1 and MMP2 in t he epiretinal and subretinal membranes of proliferative vit reoretinopat hy. Exp Eye Res1999;68(1):91
4 Yang YN, Bauer D, Wasmuth S, et al. Matrix metalloproteinases (MMP2 and 9) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMP1 and 2) during the course of experimental necrotizing herpetic keratitis. Exp Eye Res2003;77(2):227237
5 Lafleur MA, Forsyth PA, Atkinson SJ, et al. Perivascular cells regulate endothelial membrane type1 matrix metalloproteinase activity. BiochemBiophys Res Commun2001;282:463 473 上一页 [1] [2] |
