作者：熊宇　夏晓波　许惠卓　蒋剑　宋伟涛　刘双珍　许雪亮   

    作者单位：（410008）中国湖南省长沙市，中南大学湘雅医院眼科

    【摘要】目的：探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）特异性小片段干扰性RNA（siRNA）对小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的抑制作用。

    方法：构建HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α。选择7d龄C57BL/6J小鼠24只，其中6只为正常组（A）；另18只建立缺氧诱导的视网膜新生血管模型，并随机分为：对照组（B）、空载体组（C组）和基因治疗组（D组），每组6只。于出舱前1d，向空载体组小鼠玻璃体腔注射pSUPER空载体质粒；基因治疗组注射HIF-1α siRNA 重组质粒pSUPERsiHIF-1α。采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态变化； SP免疫组织化学检测各组间HIF-1α的表达差异。

    结果：荧光造影视网膜铺片显示，A组整个视网膜血管分布呈均匀网状；B、C组视网膜中周部可见大片无灌注区，见新生血管丛，伴荧光渗漏；D组无灌注区较B，C组明显减少，周边部毛细血管网基本正常，新生血管丛明显减少。免疫组织化学染色显示，A组HIF-1α蛋白表达阴性；B，C组在神经节细胞层呈阳性表达； D组在神经节细胞层呈弱阳性表达，较B，C组明显减少。

    结论：采用玻璃体腔注射，通过脂质体介导HIF-1α siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α转染视网膜，有效地抑制了缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-1α蛋白质的表达及视网膜新生血管的形成。

    【关键词】  小干扰RNA　缺氧诱导因子-1α　视网膜新生血管　基因治疗

    Inhibitory effect of interfering RNA targeting HIF-1α protein in mice retina

    Yu Xiong, Xiao-Bo Xia, Hui-Zhuo Xu, Jian Jiang, Wei-Tao Song, Shuang-Zhen Liu, Xue-Liang Xu

    Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 030471853)

    Department of Ophthalmology, Xiangya Hospital of Central-South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

    Abstract AIM: To investigate the inhibitory effect of interfering RNA targeting HIF-1α protein in the retina of mice.METHODS: HIF-1α siRNA was constructed (pSUPERsiHIF-1α). There were 6 seven-day-old C57BL/6J mice in the normal group (A), and another 18 mice were divided randomly into control group (B), vector group (C) and gene therapy group (D), with 6 mice in each group, which were induced for retinal neovascularization by hypoxia. Liposome with vector plasmid and HIF-1α siRNA were injected into the vitreous in the vector group and gene therapy group respectively at 1 day before mice were moved out to room air from the cabin. FITC-Dextran angiography was used to observe the pattern of the retinal vascular. The expression of HIF-1α protein among each group was detected using SP immunohistochemistry.RESULTS: Retinal flat-mounts after FITC-Dextran angiography indicated that the vessels of normal mice formed a fined radial branching pattern in group A. While the large vessels were distorted, the capillary was obstructed, neovascular clusters proliferated and fluorescence leaked in the periphery of the retina in groups B and C. After transfection of HIF-1α siRNA into the retina, the retinal neovascularization and non-perfusion distraction in group ) reduced and the structure of retina were more regular than those in groups B and C. Immunohistochemical staining showed that HIF-1α expressed mainly in the retinal ganglion cell layer in groups B and C, but not in group A. After transfection of HIF-1α siRNA into the retina, the expression of HIF-1α was downregulated compared with groups B and C. CONCLUSION: The development of retinal neovascularization is inhibited markedly by intravitreal injection of HIF-1α specific recombinant plasmid pSUPERsiHIF-1α, which suggests that it may have a potential therapeutic approach in retinal vascular disease.

    · KEYWORDS: RNA small interference; hypoxia inducible factor-1α; retinal neovascularization; gene therapy

    0引言

    视网膜缺血缺氧导致的视网膜新生血管性疾病如糖尿病性视网膜病变等为一组严重的致盲疾病。目前,临床上使用光凝术预防和治疗其新生血管的形成，但是,光凝存在许多并发症和副作用，如术后相应视野缩小、光凝过量还可引起出血、脉络膜新生血管形成等。因而非常有必要从基因和分子水平寻求抑制视网膜新生血管形成的方法。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，对血管形成具有重要作用[1]。同时，VEGF的活性亦受到多种因素的调控。近年来的研究发现，VEGF在缺氧组织中的转录活化主要受缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）调节，并保持其mRNA的稳定性[2]。因此，以HIF-1α和VEGF为靶点的基因治疗将为有效抑制视网膜新生血管的形成提供新途径。我们以RNA干扰为基础，采用脂质体介导的转染方法，研究HIF-1α小片段干扰性RNA（small interference RNA，siRNA）对缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-1α蛋白质的表达及视网膜新生血管形成的抑制作用。

    1材料和方法

    1.1材料 C57BL/6J小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。脂质体LipofectamineTM 2000（LF2000）和Trizol均购自美国Invitrogen公司。FITC-Dextran 购自美国sigma公司。山羊抗鼠HIF-1α抗体购自美国Santa Cruz公司。根据人类基因库中人HIF-1α基因（NM_001530）的mRNA序列设计siRNA作用靶点，其靶序列为AAGAGGTGGATATGTCTGG （1214－1232）。化学合成64nt的shHIF-1α（HIF-1α小发夹RNA）寡核苷酸序列并退火形成双链模板。采用Hind 和Bgl 双酶切pSUPER.retro空载体质粒，然后与退火形成的双链模板体外连接，经转化、筛选等步骤后抽提HIF-1α siRNA重组质粒，并命名为pSUPERsiHIF-1α。并测序鉴定重组质粒中shHIF-1α寡核苷酸插入序列的准确性。

    1.2方法 采用Smith 等[3]的氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型。将18只出生7d后(P7)的C57BL/6J小鼠及其母鼠置于密闭的氧舱，温度控制在（21±1）℃，舱内通入100 %湿润的医用氧气，用CYS-I型数字测氧仪测量氧舱的氧气体积分数，每6h一次，控制氧气体积分数(750±20)mL/L，5d后(P12) 回到正常氧环境，氧气体积分数为(200±10)mL/L，制作缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型，并随机分为对照组（B组）、空载体组（C组）和基因治疗组（D组），每组6只。另取6只正常的P19 C57BL/6J小鼠作为对照（A组）。在小鼠出舱的前1d，向空载体组（C组）小鼠玻璃体腔注射空载体质粒（pSUPER.retro）-脂质体复合物共1μL；基因治疗组（D组）小鼠注射HIF-1α siRNA重组质粒（pSUPERsiHIF-1α）-脂质体复合物共1μL。注射完后立即放回氧舱，1d后小鼠重新出舱。对照组小鼠不作转染。

    1.2.1视网膜 FITC-dextran荧光造影从各组中随机取出19d龄（P19）小鼠2只，以100 mL/L水合氯醛(5mL/kg)ip麻醉小鼠后,打开胸腔,抽取配置的FITC-Dextran (50mg:1mL蒸馏水,10 000 rpm)1mL,用25G 1mL注射器灌注左心室后,迅速摘除眼球, 置于40g/L多聚甲醛20min。在便携式显微镜下，沿角巩膜剪开眼球,去除角膜、晶状体，用自制玻璃棒小心娩出视网膜，放射状剪开，置于干净载玻片上，铺平，滴20g/L明胶一滴,盖上盖玻片，置于Olympus BX50荧光显微镜下，采用激发光波长490nm及滤过波长520nm观察并比较视网膜血管形态的变化，同时照相。

    1.2.2视网膜HIF-1α蛋白质的表达 采用链亲和素（streptavidin，SP）法检测视网膜中HIF-1α的表达。4组各剩余4只小鼠于出舱后2h，经10g/L戊巴比妥钠30mg/kg ip麻醉后摘除眼球，40g/L多聚甲醛固定过夜，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，切片方向与视轴相平行，连续切片的厚度为6μm，每只眼球随机取出4张切片，常规脱蜡至水，滴加30g/L H2O2于切片上10min，阻断内源性过氧化氢酶，PBS冲洗 3min×3次，放入枸橼酸盐缓冲液中（PH6.0）95℃修复15min，滴加试剂A（山羊血清工作液）室温封闭10min，加一抗（1∶100山羊抗鼠HIF-1α抗体）4℃过夜，次日PBS冲洗3min×3次，滴加试剂B（生物素标记的兔抗羊）室温10min, PBS冲洗3min×3次，滴加试剂C（辣根酶标记的链霉卵蛋白素工作液）室温10min，PBS冲洗3min×3次，DAB显色5min，自来水冲洗，苏木素复染30s，脱水透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察4组小鼠视网膜中HIF-1α的表达差异，在细胞核中发现棕色颗粒判定为阳性表达。

    2结果

    2.1视网膜FITC-dextran荧光造影A组P19小鼠视网膜血管基本成熟,自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布，直至视网膜周边部，有些在周边部仍较粗，形成沿周边部视网膜走行的弓形血管。视网膜血管交叉成网状，分深浅两层，浅层血管较细，呈分支状；深层血管较粗，呈网状。B、C组P19小鼠视网膜血管形态和分布发生了明显变化，视网膜大血管不规则扩张，走行迂曲，中周部大片无灌注区，可见新生血管丛，伴荧光渗漏。D组P19小鼠视网膜血管网状结构基本可见，血管迂曲及不规则扩张较B、C组明显减轻，无灌注区及新生血管丛明显减少，视网膜血管网状结构基本正常（图1）。

    2.2视网膜HIF-1α的表达 在正常视网膜组织中（A组）HIF-1α蛋白表达阴性；在高氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型（B组）及空载体注射组（C组）视网膜中HIF-1α蛋白质主要表达在神经节细胞层（阳性）；基因治疗组（D组）HIF-1α蛋白在神经节细胞层的表达呈弱阳性，较B、C组明显减少（图2）。

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